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中华人民共和国国家标准 GB 5413.14—2010 中华人民共和国卫生部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定 National food safety standard Determination of vitamin B 12 in foods for infant s and young children, milk and milk products GB 5413.14—2010 I 前 言 本标准代替GB/T 5413.14-1997 《婴幼儿食品和乳粉 维生素B 12的测定》。 本标准与GB/T 5413.14-1997 相比,主要变化如下: ——标准名称改为《婴幼儿食品和乳品中维生素B 12的测定》。 本标准附录A 为规范性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: ——GB 5413-1985 、GB/T 5413.14-1997 。 GB 5413.14—2010 1 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定方法。 本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本 适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。 3 原理 利用莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii )对维生素 B12的特异性和灵敏性,定量测定出 试样中维生素 B12的含量。在测定用培养基中供给除维生素 B12以外的所有营养成分,这样微生物生长 产生的透光率就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中维生素 B12的含量相对应。 以不同浓度标准溶液 的透光率相对于各浓度水平标准物质的浓度绘制标准曲线,根据标准曲线即可计算出试样中维生素 B12 的含量。 4 试剂和材料 除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682 规定的二级水。 4.1 菌株:莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii )ATCC 7830 。 4.2 维生素 B 12 (Vitamin B 12或Cyanocobalamin )标准品:分子式 C 63H88CoN 14O14P,纯度≥99% 。 4.3 培养基 4.3.1 乳酸杆菌琼脂培养基:见附录 A。 4.3.2 乳酸杆菌肉汤培养基:见附录 A。 4.3.3 维生素 B12测定用培养基:见附录 A。 注:一些商品化合成培养基效果良好,商品化合成培养基按标签说明进行配制。 4.4 9 g/L氯化钠溶液(生理盐水) 称取 9.0 g氯化钠溶解于 1000 mL 水中,分装于具塞试管,每管 10 mL。121 ℃灭菌 15 min。 4.5 乙醇溶液:体积分数为 25 %。 4.6 无水磷酸氢二钠(Na 2HPO 4)。 4.7 无水偏重亚硫酸钠(Na 2S2O5)。 4.8 柠檬酸(含一个结晶水)(C 6H8O7•H2O)。 4.9 标准溶液的制备 4.9.1 维生素 B12贮备液( 10 μg /mL):精确称取维生素 B12标准品( 4.2),用乙醇溶液(4.5 )定容 至维生素 B12浓度为 10 μg /mL。 GB 5413.14—2010 2 4.9.2 维生素 B12中间液(100 ng/mL ):用乙醇溶液(4.5 )将 5.0 mL维生素 B12贮备液(4.9.1 )定 容至 500 mL。 4.9.3 维生素 B12工作液(1 ng/mL ):用乙醇溶液(4.5 )将 5.0 mL维生素 B12中间液(4.9.2 )定容 至500 mL。 4.9.4 标准曲线工作液:分别吸取两个 5 mL维生素 B12工作液( 4.9.3)于 250mL和500mL容量瓶中, 用水定容至刻度。高浓度溶液的浓度为 0.02 ng/mL ;低浓度溶液的浓度为 0.01 ng/mL 。 注:所有标准溶液要储存于冰箱内。4.9.1 、4.9.2和4.9.3保存期三个月,4.9.4 临用前配制。 5 仪器和设备 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 5.1 天平:感量为 0.1 mg。 5.2 pH计:精度≤0.01。 5.3 分光光度计。 5.4 涡旋混合器。 5.5 离心机:转速≥2000 转/分钟。 5.6 恒温培养箱:36 ℃ ± 1 ℃。 5.7 冰箱:2 ℃~ 5 ℃。 5.8 无菌吸管:10 mL (具 0.1 mL刻度)或微量移液器和吸头。 5.9 瓶口分液器:0 mL ~10 mL。 5.10 锥形瓶:200 mL 。 5.11 容量瓶(A 类):100 mL ,250 mL ,500 mL。 5.12 单刻度移液管(A 类):容量 5 mL。 5.13 漏斗:直径 90 mm。 5.14 定量滤纸:直径 90 mm。 5.15 试管:18 mm ×180 mm 。 注:准备玻璃仪器时, 使用活性剂对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗, 清洗之后要求在 200 ℃干热 2 h。 6 分析步骤 6.1 测试菌液的制备 6.1.1 将莱士曼氏乳酸杆菌 (ATCC 7830 ) 的冻干菌株 (4.1 ) 活化后, 接种到乳酸杆菌琼脂培养基 (4.3.1) 上,36 ℃ ±1 ℃培养 24 h。再转种 2代~3代来增强活力。置 2 ℃~5 ℃冰箱保存备用。每 15 d转种一 次。 6.1.2 将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基(4.3.2 )中,36 ℃ ± 1 ℃培养 18 h~ 24 h,以 2000 转/分钟离心 2 min~3 min,弃去上清液,加入 10 mL生理盐水(4.4),混匀,再离心 2 min~3 min, 弃去上清液,再加入 10 mL生理盐水(4.4),混匀。如前离心操作,弃去上清液。再加 10 mL生理盐 水(4.4),混匀。吸适量该菌悬液于 10 mL生理盐水(4.4 )中,混匀制成测试菌液。 6.1.3 用分光光度计(5.3),以生理盐水(4.4)做空白,于 550 nm波长下测测试菌液(6.1.2)的透 光率,使其透光率在 60 %~80 %之间。 6.2 试样的处理
GB 5413.14-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定
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