中华人民共和国国家标准 GB4789.41—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验 2016-08-31发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 国家卫生和计划生育委员会发布GB4789.41—2016 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验 1 范围 本标准规定了食品中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的检验方法。 本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数;第二法适用于肠杆菌科含量较 低食品中肠杆菌科的计数。 2 术语和定义 2.1 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.2 肠杆菌科计数 EnumerationofEnterobacteriaceae 按本标准规定方法,对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。 2.3 最可能数 mostprobablenumber;MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 3.1 恒温培养箱:36℃±1℃。 3.2 冰箱:2℃~5℃。 3.3 水浴箱:46℃±1℃。 3.4 天平:感量0.1g。 3.5 显微镜:10倍~100倍。 3.6 均质器。 3.7 振荡器。 3.8 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。 3.9 无菌锥形瓶或等效容器:容量150mL、500mL。 3.10 无菌培养皿:直径90mm。 3.11 无菌试管:18mm×180mm、15mm×150mm。 3.12 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 4 培养基和试剂 4.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见B.1。GB4789.41—2016 2 4.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE肉汤):见B.2。 4.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA):见B.3。 4.4 营养琼脂(NA):见B.4。 4.5 葡萄糖琼脂:见B.5。 4.6 革兰氏染色液:见B.6。 4.7 氧化酶试剂:见B.7。 4.8 无菌1mol/LNaOH:见B.8。 4.9 无菌1mol/LHCl:见B.9。 第一法 肠杆菌科平板计数法 5 检验程序 肠杆菌科平板计数法检验程序见图1。 图1 肠杆菌科平板计数法检验程序GB4789.41—2016 3 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中,8000r/min~ 10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mLBPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1min~2min,制成1∶10的样品匀液。 6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品放入盛有225mLBPW的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数 量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。 6.1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入盛有9mLBPW的 无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打, 使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。 6.1.4 按6.1.3操作程序,依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无 菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。 6.2 倾注平板和培养 6.2.1 根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液 体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌平皿。同时,分别吸取1mLBPW加入两个无菌平皿 内作为空白对照。 6.2.2 将10mL~15mL冷却至46℃的VRBGA(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿,使样品匀液与培养基充分混匀。 6.2.3 待琼脂凝固后,倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为 明显。 6.2.4 待VRBGA平板上层琼脂凝固后翻转平板,36℃±1℃培养18h~24h。 6.3 典型菌落计数和确认 6.3.1 肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在15CFU~ 150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板,只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位(colony- formingunits,CFU)表示。 6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以 2,代表一个平板菌落数。 6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。 6.3.4 从每个平板上至少挑取5个(小于5个全选)典型菌落进行确认;如果有不同形态的典型菌落,则 每种形态分别至少挑取1个菌落进行确认。 6.3.5 典型菌落的确认: a) 分别将所挑选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板,36℃±1℃培养18h~24h,挑取平板上 的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。 b) 革兰氏染色镜检:肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌,无芽孢,大小为(0.3~1.0)μm×(1.0~ 6.0)μm。 c) 氧化酶试验:用铂/铱接种环或玻璃棒(不要用镍铬接种环)挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂