(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210760431.2 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 浙江大学 地址 310030 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 庄乐南　张元　贺津　刘艳　 (74)专利代理 机构 北京挺立专利事务所(普通 合伙) 11265 专利代理师 余莹 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/877(2010.01) A01K 67/027(2006.01) C12N 5/10(2006.01)C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) A61K 49/00(2006.01) (54)发明名称 靶向敲除KCNH2基因的sgRNA及其用途 (57)摘要 本发明涉及基因工程技术领域， 尤其涉及靶 向敲除KCNH2基因的sgRNA及其用途， 还涉及利用 上述sgRNA敲除KCNH2基因得到的猪胚胎成纤维 细胞， 以及利用上述猪胚胎成 纤维细胞生产遗传 性长QT综合征基因突变猪的方法。 本发 明提供的 sgRNA编辑效率较高， 特异性好。 利用该sgRNA敲 除KCNH2基因， 得到猪胚胎成纤维细胞单克隆细 胞株， 利用其构建得到一种常染色体显性遗传长 QT综合征基因突变猪模 型。 本发明建立的基因突 变猪模型可用于常染色体显性遗传长QT综合征 的研究及药物筛 选， 具有很高的应用研究价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表17页 附图3页 CN 114990121 A 2022.09.02 CN 114990121 A 1.一种靶 向敲除KCNH2基因的sgRNA， 其特征在于， 所述sgRNA含SEQ  ID NO.1所示的核 苷酸序列。 2.编码权利要求1所述sgRNA的DNA分子 。 3.一种载体， 其特 征在于， 所述载体包 含权利要求2所述DNA分子 。 4.一种敲除了KCNH2基因的细 胞的构建方法， 其特征在于， 包括： 利用CRISPR ‑Cas9系统 敲除所述细胞的KCNH2基因， 所述CRISPR ‑Cas9系统使用权利要求1所述的sgRNA； 所述利用 CRISPR‑Cas9系统敲除所述细胞的KCNH2基因中使用pX459载体； 所述细胞为猪胚胎成纤维 细胞。 5.一种猪胚胎成纤维细胞， 其特征在于， 所述猪胚胎成纤维细胞由权利要求4所述构建 方法得到 。 6.用于鉴定权利要求5所述猪胚胎成纤维细胞的突变类型的引物对， 其特征在于， 所述 引物对的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2和SEQ  ID NO.3所示。 7.一种遗传性长QT综合征基因突变猪的生产 方法， 其特征在于， 包括下述步骤： 利用权 利要求1所述sgRNA在猪KCNH2基因7号外 显子第1873 ‑1874位点处引入 插入或缺失突变。 8.根据权利 要求7所述的生产方法， 其特征在于， 所述插入突变为猪KCNH2基因7号外显 子第1873 ‑1874位点处引入 “A”的插入突变， 或所述缺失突变为猪KCNH2基因7号外显子第 1873‑1874位点处引入 “T”的缺失突变， 或所述缺失突变为猪KCNH2基因7号外显子第1873 ‑ 1874位点处引入“TG”的缺失突变。 9.根据权利要求7或8所述的生产方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)筛选猪KCNH2基因突变的阳性猪细胞 克隆点； 2)将筛选出阳性猪细胞克隆点的细胞核用体细胞核移植技术转入去核的卵母细胞中， 在体外培养成重构胚， 非手术法将其移入代孕母猪子宫中， 妊娠生产出 克隆猪； 3)鉴定出 KCNH2基因突变的克隆猪。 10.权利要求7 ‑9任一项所述的生产方法构建的基因突变猪， 或权利要求5所述的猪胚 胎成纤维细胞在针对遗传性长QT综合征进行 药物实验和临床前 药物筛选中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990121 A 2靶向敲除KCNH2基因的sgRNA及其用途 技术领域 [0001]本发明属于基因工程技术领域， 涉及靶向敲除KCNH2基因的sgRNA及其用途， 具体 涉及利用该sgRNA敲除KCNH2基因的猪胚胎成纤维细胞及一种遗传性长QT综合征基因突变 猪的生产方法及其应用。 背景技术 [0002]长QT综合征(LQTS)是一种家族性的原发性心律失常综合征， 以QT延长和心电图T 波异常为特征， 是一类异质性心脏电生理学疾病。 据统计， 先天性LQTS的发病率高达1/ 2000‑2500， 发病年龄不定， 患者可能终身无症状， 也可能在婴儿期发生猝死。 除少量 Jervell和Lange ‑Nielsen综合征(JLNS)： 一种以伴随严重的心脏表型和感觉神经性听力损 失为特征的常染色体隐性遗传情况， LQTS通常为常染色体显性遗传(Romano ‑Ward综合征)。 临床症状包括心悸、 晕厥和继发于室性心律失常的缺氧性癫痫发作， 典型 的尖端扭转型室 性心动过速， 以及在心脏结构正常的其他健康年轻个体中心脏性猝死(S CD)的风险增加等， 大多数发病情况与身体活动和情绪压力有关。 LQTS特征是心室心肌复极延迟， QT延长(人类 QTC>480ms)， 而体表心电图上的QT间期是单个心室细胞动作电位持续时间的总和， 是细胞 膜复极异常的替代标志。 因此， 这种易发的恶性心律失常是 由心肌细胞动作电位复极延迟 的心脏离子通道异常导致的。 虽然LQTS的特点是反复晕厥、 心脏骤停， 但只有约60％的患者 在诊断时有症状。 [0003]目前， 研究显示有17种不同的LQTS 亚型与15个常染色体显性基因的单基因突变有 关。 而导致LQTS的主要的基因有三个——KCNQ1、 KCNH2和SCN5A， 约占90％的基因型阳性患 者和75％的LQTS临床诊断患者。 IKs和IKr是延迟整流器IK电流的慢速和快速分量， 是心脏 动作电位第3阶段的主要决定因素。 LQT1是由KCNQ1的功能丧失突变引起的， KCNQ1编码缓慢 激活的α 亚基钾通道Kv7.1， 导致IKs电流降低。 LQT2与KCNH2(hERG)功能丧失突变和快速激 活钾电流IKr降低有关。 LQT3是由SCN5A功能获得性突变引起的， 导致动作电位平台期和晚 期INa电流增加。 其他几个基因， 也称为次要LQTS基因， 已被确定并共同占约5％的临床诊断 LQT病例。 [0004]本发明主要针对KCNH2相关的LQT2， 为了研究LQT2的机理及 筛选治疗药物， 人们建 立了大量模型， 包括文献Friedrichs  S,Malan D,Sasse P.Modelin g long QT syndromes   using induced pluripotent  stem cells:Current  progress  and future challenges [J].Trends  Cardiovasc  Med,2013,23(4):91‑98中总结的一种通过iPS细胞衍生的心 肌细 胞来模拟不同的LQTS表型的细胞模型， 但因为细胞模型不同于成人心室肌细胞， 具有未成 熟的t‑微管、 早期分化阶段钠通道的低表达以及不 成熟的基因表达谱。 并且， 单个心肌细胞 的电活动不能代表它们在心脏中的排列和 三维方向以及细胞之间的传导都是正常电活动 的关键决定因素。 此外， 心脏不同区域以及心内膜和心外膜之间动作电位持续时间的微调 差异会影响心 律失常的产生。 最后， 培养皿中的iPS细胞衍生的心肌细胞缺乏周围的心脏成 纤维细胞， 可能会受到塑料基质的压力， 并且培养基可能无法正确支持新陈代谢。 因此， 心说　明　书 1/6 页 3 CN 114990121 A 3