(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210723469.2 (22)申请日 2022.06.23 (71)申请人 中国水产科 学研究院淡水渔业研究 中心 地址 214028 江苏省无锡市山水东路9号 (72)发明人 乔慧　程丹　傅洪拓　张文宜　 蒋速飞　熊贻伟　金舒博　龚永生　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 2321 1 专利代理师 林娟 (51)Int.Cl. C12N 9/64(2006.01) C12N 15/57(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01)A61K 31/713(2006.01) A61K 9/00(2006.01) A61P 15/00(2006.01) (54)发明名称 青虾Cathepsi n D基因及其dsRNA的应用 (57)摘要 本发明公开了青虾Cathepsin  D基因及其 dsRNA的应用， 属于生物技术领域。 首先获得青虾 Cathepsin  D基因， 其核苷酸全长序列为SEQ  ID  NO： 1， 氨基酸序列为SEQ  ID NO： 2。 而后利用RNA 干扰等技术获得序列为SEQ  ID NO： 3基因片段， 并以此基因片段为模板合成dsRNA1。 将dsRNA1注 入雌性青虾围心腔后， 在第10、 2 0和30天， dsRNA1 组青虾的性腺发育指数分别为1.45％， 1.64％和 1.79％， 均显著低于对照组和dsRNA2组。 由此可 见， dsRNA1可以有效减缓雌性青虾卵巢发育速 度。 权利要求书1页 说明书4页 序列表5页 附图1页 CN 115011584 A 2022.09.06 CN 115011584 A 1.青虾的Cathepsin  D基因或组织蛋白酶D作为靶标在抑制青虾卵巢发育或制备青虾 卵巢发育的抑制剂中的应用； 所述Cathepsi n D基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示； 所述组织蛋白酶D的氨基酸序列如SEQ  ID NO： 2所示。 2.一种高效的青虾Cathepsin  D干扰基因片段， 其特征在于， 核苷酸序列为SEQ  ID NO： 3。 3.扩增权利要求2所述青虾Cathepsin  D干扰基因片段的引物组， 其特征在于， 上游引 物的核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示的核苷酸序列， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.5 所示的核苷酸序列。 4.一种用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA， 其特征在于， 所述dsRNA是以权利要求2所述青 虾Cathepsi n D干扰基因片段为模板体外转录获得。 5.一种制备用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA的方法， 其特征在于， 所述方法为， 以以权 利要求2所述青虾Cathepsi n D干扰基因片段为模板转录得到dsRNA。 6.权利要求4所述dsRNA抑制青虾Cathepsin  D基因表达、 抑制青虾卵巢发育或制备抑 制青虾卵巢发育的产品中的应用。 7.一种生物抑制剂， 其特 征在于， 含有权利要求 4所述所述dsRNA。 8.一种抑制青虾卵巢发育的方法， 其特征在于， 所述方法为将权利要求4所述dsRNA或 权利要求7 所述生物抑制剂处 理青虾。 9.一种抑制青虾卵巢发育的试剂盒， 含有权利要求4所述dsRNA或权利要求7所述生物 抑制剂。 10.核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示的青虾Cathepsin  D基因、 氨基酸序列如SEQ  ID  NO： 2所示的青虾Cathepsin  D基因编码的组织蛋白酶D、 权利要求2所述青虾Cat hepsin D干 扰基因片段、 权利要求4所述dsRNA、 权利要求7所述生物抑制剂、 权利要求8所述方法或权利 要求9所述试剂盒在青虾养殖 方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011584 A 2青虾Cathepsin  D基因及其dsRNA的应用 技术领域 [0001]本发明涉及青虾Cathepsi n D基因及其dsRNA的应用， 属于生物技 术领域。 背景技术 [0002]青虾， 学名日本沼虾(Macrobrachium  nipponense)， 俗称为河虾， 是中 国重要的淡 水养殖虾类之一。 雌性青虾具有 “性快熟”的特点， 在进入繁殖季节后， 虾 苗放养45天左右可 以达到性成熟， 当年生的雌虾可繁殖多代。 特别是在夏季水温较高时期， 雌虾 一个卵巢 成熟 周期只需要15天时间。 这一特点是多年来一直困扰青虾产业的重要问题。 卵巢快速成熟导 致青虾繁殖过快， 引起多代同堂， 继而引发养殖密度过高、 缺氧风险显著提高、 饲料消 耗增 大等问题， 严重影响了养殖的经济效益， 更给家系选育等科研工作造成难题。 因此， 找到控 制青虾卵巢快 熟的方法， 对于青虾产业 健康高效的发展意 义重大。 [0003]组织蛋白酶D(Cathepsin  D)广泛存在于各种生物体中， 属于酸性溶酶体内切蛋白 酶， 能够水解胞内蛋白和多肽， 维持细胞稳态。 在人和哺乳动物中， 组织蛋白酶D参与激活酶 原和生长因子、 大脑抗原呈递、 表皮 分化及细胞凋亡等多种机体生理 活动。 [0004]RNAi(RNA interference,RNA i)技术是利用双链RNA在Dicer酶作用下形成众多小 的RNA片段， 最终引起靶向mRNA发生降解， 导致细胞或个体不能合成相应的氨基酸， 引起个 体功能表现缺失， 达到干扰敲除的目的。 已有研究证实， 对青虾卵黄蛋白原基因进行RNAi， 可有效抑制青虾卵巢发育(Bai  et al,2015)。 证明RNAi技术在解决青虾 “性快熟”问题中具 有很好的应用前 景。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种青虾Cathepsin  D基因、 干扰基因片段及其dsRNA和 dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用， 该基因可用于减缓雌性青虾卵巢 发育成熟速度， 为解 决青虾“性快熟”问题及遗传育种改良提供新的思路。 [0006]技术方案 [0007]本发明提供了一种青虾Cathepsi n D基因， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示。 [0008]本发明提供了一种青虾组织蛋白酶D， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO： 2所示。 [0009]本发明还提供了所述的青虾的Cathepsin  D基因或青虾的组织蛋白酶D作为靶标 在抑制青虾卵巢发育或制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用。 [0010]本发明提供了一种高效的青虾Cathepsin  D干扰基因片段， 其核苷酸序列为SEQ   ID NO： 3。 [0011]本发明还提供了扩增所述青虾Cathepsin  D干扰基因片段 的引物组， 上游引物的 核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示的核苷酸序列， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  IDNo.5所示 的核苷酸序列。 [0012]本发明提供的一种青虾Cathepsin  D干扰基因片段获取方法如下： 对青虾 Cathepsin  D氨基酸序列分析后， 选择Cathepsin  D特异性区域， 设计了两对干扰引物， 一是说　明　书 1/4 页 3 CN 115011584 A 3