(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210927889.2 (22)申请日 2022.08.03 (71)申请人 河北工程大 学 地址 056000 河北省邯郸市经济技 术开发 区太极路19号 (72)发明人 刘利强　 (74)专利代理 机构 北京汇彩知识产权代理有限 公司 11563 专利代理师 王键 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 雏鸡体内粪肠球菌和屎肠球菌双重定量PCR 检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种雏鸡体内粪肠球菌和屎肠 球菌双重定量PCR检测试剂盒， 包括一对特异引 物， F1 5'‑ACTTATGTGACTAACTTAACC ‑3'和F2 5'‑ TAATGGTGAATCTT  GGTTT GG‑3'； 上游引物为： P1   5′ ‑TTTACAAGCTGCTGGTGTG  C‑3′， 下游引物为： P2   5′ ‑AACCCATATTCGCAGGTTTG ‑3′； 通过DNA提取、 PCR扩增和SYBRGreen Ⅰ定量PCR标准曲线的绘制。 本发明雏鸡体内粪肠球菌和屎肠球菌双重定量 PCR检测试剂盒， 分离培养及后续的鉴定时间短， 步骤简单， 敏感性强， 操作方便的， 特异性好， 重 复性好， 能够对样品中肠球 菌准确定量。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 115094152 A 2022.09.23 CN 115094152 A 1.一种雏鸡体内粪肠球菌和屎肠球菌双重 定量PCR检测试剂盒， 其特 征在于， 引物设计与合成： 采用Primer  Express5.0软件设计一对特异引物 F1 5'‑ACTTATGTGACTA ACTTAACC‑3'和 F2 5'‑TAATGGTGAATCTT GGTTT GG‑3'， 预期扩增片段 大小360bp； 上游引物为： P1  5′ ‑TTTACAAGCTGCTG GTGTG C‑3′， 下游引物为： P2  5′ ‑AACCCATATTCGCAGGTTTG‑3′， 扩增片段的大小为140bp； DNA提取： (1)挑取已纯化的单个菌落， 置于盛有1mL营养肉汤的EP管中， 恒温37℃摇床增菌8h， 得 到的菌液12000r/min离心2min， 弃上清加入1mL灭菌 水吹吸混匀， 再离心、 弃上清， 加35 μL灭 菌水， 98℃水浴10min， 12000r/min离心1min， 收集上清液置于 无菌EP管作为DNA模板备用， ‑ 20℃保存； (2)对于从患禽采集的肝脏和肾脏， 研磨后 置于事先加入80 μL灭菌水的EP管内， 涡旋振 荡15min， 98℃水浴10mi n， 12000r/min离心1mi n， 收集上清液作为DNA模板备用， ‑20℃保存； PCR扩增： 反应体系采用25uL体系： Mix12.5uL， 上、 下游引物各0.5uL， 模板DNA1.0uL， 加灭菌双蒸 水至25uL； 反应条件为： 95℃预变性4min； 94℃30s， 58.5℃30s， 72℃55s， 35个循环； 72℃延伸 7min， 于4℃终止反应并保存； 取5uL  PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳， 凝胶成像系统观察 结果； SYBR GreenⅠ定量PCR标准曲线的绘制： 粪肠球菌、 屎肠球菌分别经脑心肉汤液体培养基培养后， 调整菌液浓度分别为4.7 × 108cfu/mL和2.3 ×108cfu/mL， 进行10倍系 列稀释； 用煮沸的方法分别提取各浓度梯度粪肠 球菌、 屎肠球菌的基因组DNA； 经定量PCR扩增 后， 以不同菌数对 数为横坐标， 以PCR反应的循 环数(Ct)为纵坐标绘制标准曲线； 采用25uL反应体系： SYBR  Premix Ex Taq(2×)12.5uL， 上、 下游引物各0.5L， DNA模板 1.0uL， 用双蒸水补足至25uL。 反应程序为： 95℃预变性 4min， 94℃30s， 58.5℃3 0s， 72℃5 5s， 进行40个 循环。 2.根据权利要求1所述雏鸡体 内粪肠球菌和屎肠球菌双重定量PCR检测试剂盒， 其特征 在于： 溶解曲线是在正常的PCR反应基础上加一个溶解曲线的反应条件， 其中当温度由60℃ 升至95℃时， PCR仪每隔一定的温度检测一次信号， 最后将收集的信号绘制出溶解曲线， 然 后将溶解曲线一次微分就会得到我们平时看到的峰性图.每一条线代表着某个孔里的反应 体系里产 物的单一情况， 利用该特点以及不同P CR产物其Tm值的不同， 因此使其荧光信号 发 生迅速下降的温度也 不同， 可通过 此对PCR的特异性进行鉴定； 采用qPCRsoft3.4系统进行分析； 分析方法和步骤： 1)、 溶解曲线纵坐标表示单位 时间内荧光信号的变化量， 当扩增产物特异， 是单一产物 时， 这个纵坐标峰值所对应的横坐标应该是一致的， 呈现单一的溶解峰， 即出现单一的Tm权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115094152 A 2值； 2)、 当不同DNA模板扩增后， 熔解曲线结果为单一波峰， 产物Tm  值均一， 可判定为此类 细菌。 3.一种雏鸡体内粪肠球菌和屎肠球菌双重定量PCR检测方法， 其特征在于， 包括用权利 要求1所述的引物对样品进行检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115094152 A 3