(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210637430.9 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 中国科学院水生 生物研究所 地址 430072 湖北省武汉市武昌东湖南路7 号 (72)发明人 柳力月　孙永华　 (74)专利代理 机构 武汉宇晨专利事务所(普通 合伙) 42001 专利代理师 江丽丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种闭管可视化检测斑马鱼 源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法， 根据鮰爱德华 氏菌保守蛋白中的假设蛋白epi18设计引物， 在 反应体系中通过pH敏感的指示剂， 可 实现闭管可 视化判定靶 标基因的目的， 该试剂盒检测灵敏度 高， DNA最低检出率为7.9  copies/μL， 特异性 强， 检测结果清晰明显， 肉眼观察即可判断； 也可 直接从病鱼脑组织直接提取DNA进行快速检测， 相较于原始 检测方法， 速度快、 可视化程度高， 具 有良好野外及资源有 限的基层实验室检测应用 的前景。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 CN 115011711 A 2022.09.06 CN 115011711 A 1.用于检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的LAMP引物组合， 其特征在于， 外引物序列如SEQ   ID NO.1和2所示， 内引物序列如SEQ  ID NO.3和4所示。 2.检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的引物组 合。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特 征在于， 外引物与内引物的浓度比1： 4 ‑8。 4.根据权利要求2至4中任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括含有pH指示剂的 LAMP反应预混液， 阳性质粒， 所述的阳性质粒为含有鮰爱德华氏菌 epi18基因的质粒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011711 A 2闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子检测技术领域， 具体涉及闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌 的试剂盒及方法。 背景技术 [0002]斑马鱼是国际上应用于科学研究最广的实验鱼类， 其健康状况和质量是开展一切 与斑马鱼相关研究工作的基础。 在斑马鱼室内养殖过程中， 各类细菌性疾病的爆发， 严重制 约了以斑马鱼为基础的相关研究工作的进展。 据报道鮰爱德华氏菌(Edwardsiella   ictaluri)是一种斑马鱼鱼房内危害比较严重的细菌性病原， 一旦在斑马鱼实验室内爆发， 传播迅速， 死亡率高达50％， 造成损失巨大， 感染存活下来的斑马鱼依旧可以携带病原， 其 粪便经健康鱼吞食， 或者通过摄食已感染鱼尸体而传染给其它健康鱼类造成第二次该类鱼 病爆发。 病鱼常表现为鱼腹部膨大， 口腔、 下颌、 眼眶、 鳃盖、 肛门及鳍条基部等部位明显充 血、 出血， 头顶正中部位皮下发红， 头背部颅侧皮肤坏死、 溃烂， 病情严重的头骨裂开暴露脑 组织等症状。 [0003]目前， 鮰爱德华氏菌的检测方法有常规的分离培养(分离培养需要至少2天时间)、 生理生化鉴定， 聚合 酶链式反应以及16S  rDNA测序等。 常规方法具有检测时间长、 耗时耗力 等缺点； 酶联免疫检测方法(ELISA)可以快速检测细菌， 但必需先制备相关抗体， 步骤繁琐 耗时。 PCR技术具有灵敏、 特异、 快速等优点， 广泛应用于水产养殖病原的检测中。 但P CR技术 对实验人员和环境的要求高， 仪器设备贵、 操作步骤多。 与一般PCR技术相比， 荧光PCR检测 技术简化了操作步骤， 而且可消除扩增产 物引起的交叉污染， 减少假阳性的发生。 但实时荧 光PCR仪器设备昂贵， 无法用于现场检测 。 因此， 建立快速、 准确、 灵敏的检测鮰爱德华氏菌 的新方法， 对于疾病的早期诊断和预警、 实时监测， 及时治疗具有重要的意 义。 [0004]环介导的等温核酸扩增 技术(LAMP)是由Notomi  T等人发明的新型核酸扩增 技术 (PMID:10871386)。 该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合 酶， 在 61‑65℃的恒温条件下完成反应， 避免了类似PCR扩增的变性、 退火、 延伸等多温度变化过 程， 极大地降低了反应 设备的生产成本； 同时其仍能保留等同于P CR技术的高灵敏度和特异 性等优点， 在快速检测领域展示出了巨大的活力。 近年来， 国内外已将该技术广泛应用于病 原体检测。 [0005]目前， 在其它物种分离的鮰爱德华氏菌检测中， 国外Yeh等已有 关于LAMP 技术的报 道(PMID:16157211)。 然而经我们实践检测发现上述报道所用引物在斑马鱼源鮰爱德华氏 菌检测中并不工作， 且对LAMP结果判定， 主要通过琼脂糖电泳实现， 而LAMP扩增产 物产量巨 大， 在开盖检测过程极易产生气溶胶等污染问题导致假阳性结果的出现。 2015年有研究报 道， 在核酸等温扩增反应过程中， 伴随着靶基因扩增产物的积累过程中， 产生了大量的H+， 使反应体系pH下降(PMID:25652028)。 因此， 可以利用pH敏感的指示剂通过颜色变化以判断 LAMP反应是否发生， 从而实现闭管可视化结果判定的目的。 目前， 尚未见pH指示剂应用于斑 马鱼源鮰爱德华氏菌LAMP检测的相关报道。说　明　书 1/4 页 3 CN 115011711 A 3