(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210708861.X (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 中南林业科技大 学 地址 410004 湖南省长 沙市韶山 南路498号 (72)发明人 王义强　吴春文　冯致　李萌　 张双全　范开范　唐建露　姚志　 王惠　孙全　周涛　 (74)专利代理 机构 长沙市融智专利事务所(普 通合伙) 43114 专利代理师 袁靖 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) G16B 20/30(2019.01)G16B 20/40(2019.01) (54)发明名称 银杏多态性EST-S SR分子标记引物及其应用 (57)摘要 本发明公开了银杏多态性EST ‑SSR分子标记 引物及其应用， 属于分子标记 开发技术及其应用 领域。 本发明从银杏转录组数据中筛选 出了EST‑ SSR位点， 并设计合成了100对引物， 以全国141份 银杏种质基因组DNA为模板通过有效性验证和多 态性筛选， 最终获得了20对稳定性好、 多态性高 的特异性EST ‑SSR分子标记引物。 本发明还进一 步公开了上述自主开发的分子标记引物在银杏 遗传多样性分析及核心种质构建等方面的应用。 本发明提供的ES T‑SSR分子标记引物为银杏遗传 进化分析、 亲缘关系鉴定和良种选育等研究提供 理论与技术支撑， 对于银杏种质资源的合理利 用、 保存与保护具有重要价 值。 权利要求书2页 说明书19页 序列表7页 附图3页 CN 114875170 A 2022.08.09 CN 114875170 A 1.银杏转录组EST ‑SSR分子标记引物， 其特 征在于， 包括以下20对多态性引物： GBSSR04447‑F:5’ ‑CCGAGAGAAAGATACAGC CG‑3’； SEQ ID NO.1； GBSSR04447‑R:5’ ‑CCACAACCCAAAAAGCCTTA‑3’； SEQ ID NO.2； GBSSR05243‑F:5’ ‑CAGATTGTCATGCAC CCCTA‑3’； SEQ ID NO.3； GBSSR05243‑R:5’ ‑TCCTTGGTAACGCCATTCTC‑3’； SEQ ID NO.4； GBSSR10422‑F:5’ ‑ATCACGAT TTCTTCGTTGGG‑3’； SEQ ID NO.5； GBSSR10422‑R:5’ ‑GCTTGAATGTCCTCTGCCTC‑3’； SEQ ID NO.6； GBSSR02181‑F:5’ ‑CAGACACATGA ACCCCTTCC‑3’； SEQ ID NO.7； GBSSR02181‑R:5’ ‑ATGCCCTGGCATATTTTGAT‑3’； SEQ ID NO.8； GBSSR16030‑F:5’ ‑AAGCGTCTCGAGA AAGTGGA‑3’； SEQ ID NO.9； GBSSR16030‑R:5’ ‑TACGATGCAG GAAAACATGC‑3’； SEQ ID NO.10； GBSSR21240‑F:5’ ‑AGGAGAACAGAGGCTGTGGA‑3’； SEQ ID NO.11； GBSSR21240‑R:5’ ‑TTTGTTATTTCCGTGGGAGC‑3’； SEQ ID NO.12； GBSSR13689‑F:5’ ‑AATTTGGATGTCGC CATTGT‑3’； SEQ ID NO.13； GBSSR13689‑R:5’ ‑AAGCCCTGATATGAC CATGC‑3’； SEQ ID NO.14； GBSSR05999‑F:5’ ‑GTAGGCCTCTCCTCCAATCC‑3’； SEQ ID NO.15； GBSSR05999‑R:5’ ‑AATGGACCACATTGGGTGTT‑3’； SEQ ID NO.16； GBSSR21429‑F:5’ ‑ACCAATGGCTGTTGATGTGA ‑3’； SEQ ID NO.17； GBSSR21429‑R:5’ ‑GCAAAAACAACATCCAGGCT‑3’； SEQ ID NO.18； GBSSR25769‑F:5’ ‑CACCCCTGGGATTATTGATG‑3’； SEQ ID NO.19； GBSSR25769‑R:5’ ‑ATGAGTGGAATGTGGGCTTC‑3’； SEQ ID NO.20； GBSSR29168‑F:5’ ‑CCATGTCTC CAAGGTCGATT‑3’； SEQ ID NO.21； GBSSR29168‑R:5’ ‑CTTGGCGAATACTGCAT TGA‑3’； SEQ ID NO.22； GBSSR27072‑F:5’ ‑CAAGCAAATTAGTGCTGC CA‑3’； SEQ ID NO.23； GBSSR27072‑R:5’ ‑TGAATGCCTGATGAT TTGGA‑3’； SEQ ID NO.24； GBSSR27825‑F:5’ ‑ATGGGCGTCGTG GATAGTAG ‑3’； SEQ ID NO.25； GBSSR27825‑R:5’ ‑TTTTCCCAGATAGGCATTGG‑3’； SEQ ID NO.26； GBSSR31776‑F:5’ ‑AGTGCATTTCATTTGCTTCG‑3’； SEQ ID NO.27； GBSSR31776‑R:5’ ‑TTTCAGTCTCTGCG GGAGAT‑3’； SEQ ID NO.28； GBSSR34776‑F:5’ ‑AGAACGGTGCCAACAATAGG‑3’； SEQ ID NO.29； GBSSR34776‑R:5’ ‑TCCCTGATTGCCAAAGTAGG‑3’； SEQ ID NO.30； GBSSR31083‑F:5’ ‑AAGTGGAGTTGTGAAACGGG‑3’； SEQ ID NO.31； GBSSR31083‑R:5’ ‑TTTAGGCTGGAATGGATTGG‑3’； SEQ ID NO.32； GBSSR27860‑F:5’ ‑AGGTGGATGGGCATATTCAG‑3’； SEQ ID NO.33； GBSSR27860‑R:5’ ‑CACAGTTGGCAGACGA AAAA‑3’； SEQ ID NO.34； GBSSR01538‑F:5’ ‑AGAGATTTTGCGACAGAGC ‑3’； SEQ ID NO.35； GBSSR01538‑R:5’ ‑GGTAGCAGT TGAACCGTTA‑3’； SEQ ID NO.36； GBSSR00112‑F:5’ ‑AGGGAAAAAGTGAAAGAGAGAG ‑3’； SEQ ID NO.37； GBSSR00112‑R:5’ ‑CTAGTCAAGGCGAGGTTAAAGA‑3’； SEQ ID NO.38；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875170 A 2GBSSR10214‑F:5’ ‑TTTGGGAGTAGTGTGT TGT‑3’； SEQ ID NO.39； GBSSR10214‑R:5’ ‑CTGGATTGCATTTGAAGTC‑3’； SEQ ID NO.40。 2.权利要求1所述的银杏转录组EST ‑SSR分子标记引物在银杏遗传多样性分析中的应 用。 3.如权利要求2所述的应用， 其特征在于， 利用所述的银杏转录组EST ‑SSR分子标记引 物进行SSR ‑PCR扩增时， 体系为10 μL， 包括2x  TSINGKE Master Mix 5 μL； 2 μmol/L  SSR引物 各1 μl； ＜1 μg  DNA模板； 最后加d dH2O补至10 μL； 利用所述 的银杏转录组EST ‑SSR分子标记引物进行SSR ‑PCR扩增时， SSR ‑PCR扩增程序 为； 96℃预变性2min； 96℃变性10s； 退火温度54 ‑60℃、 复性 时间30s； 72℃延伸1min， 30 ‑35 个循环； 72℃延伸1mi n； 4℃保存。 4.如权利要求2所述的应用， 其特 征在于， 具体包括如下步骤： (1)基于权利要求2所述EST ‑SSR多态性引物， 获得EST ‑SSR分子标记数据； (2)基于上述EST ‑SSR分子标记数据， 利用生物信息学软件对银杏进行遗传多样性分 析。 5.如权利要求 4所述的应用， 其特 征在于， 包括： 1)将获得的20对多态性EST ‑SSR分子标记数据输入软件， 计算平均期望杂合度或称基 因多样性指数、 Shan non多样性指数、 基因分化系数和基因流； 2)再对银杏群体进行遗传多样性分析， 包括： 等位基因数、 有效等位基因数、 观测杂合 度和群体的基因多样性指数； 3)利用软件进行分子方差分析； 4)利用软件进行UPGMA聚类分析。 6.权利要求1所述银杏 转录组EST ‑SSR分子标记引物在银杏核心种质构建中的应用。 7.如权利要求6所述的应用， 其特征在于， 利用所述的银杏转录组EST ‑SSR分子标记引 物进行SSR ‑PCR扩增时， 体系为10 μL， 包括2x  TSINGKE Master Mix 5 μL； 2 μmol/L  SSR引物 各1 μl； ＜1 μg  DNA模板； 最后加ddH2O补至10 μL； 利用所述的银杏转录组EST ‑SSR分子标记引 物进行S