(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211213829.0 (22)申请日 2022.09.30 (66)本国优先权数据 202211097090.1 202 2.09.08 CN (71)申请人 南京诺因生物科技有限公司 地址 210000 江苏省南京市江北新区新锦 湖路3-1号中丹生态生命科学产业园 一期A座1802-1807 (72)发明人 易康　朱祥羽　顾立江　樊晓梅　 (74)专利代理 机构 合肥禾知 知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 34246 专利代理师 张肖肖 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 鉴别非结核、 结核分枝 杆菌及其利福平耐药 性的检测方法、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种鉴别非结核、 结核分枝 杆 菌及其利福平耐药性的组合物， 包括引物组和探 针组， 利用结核分枝杆菌、 非结核分枝杆菌以及 利福平的耐药位点的特征性序列设计不同的引 物和探针， 再通过多重荧光PCR扩增即可快速得 到检测结果。 还公开了包含该组合物的试剂盒。 本发明建立了可快速检测非结核、 结核分枝 杆菌 及其利福平耐药性的检测方法， 该方法操作简 单， 可快速得到 检测结果， 满足临床需求。 权利要求书2页 说明书8页 CN 115418407 A 2022.12.02 CN 115418407 A 1.一种鉴别非结核、 结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物， 包括引物组和探针组， 所述引物组包括： NTM引物： NTM‑F： 5’ ‑GGAAGTYGCCAAGAAGACYGAC‑3’ NTM‑R： 5’ ‑CTTSAGACCCAKCGGGTT‑3’ MTBC引物： MTBC‑F： 5’ ‑CAGGACCACGATCGCTGA ‑3’ MTBC‑R： 5’ ‑TAGGTGCTGGTGGTCCGA‑3 人源基因引物： IC‑F： 5’ ‑CGGAGGGAAGCTCATCAG ‑3’ IC‑R： 5’ ‑CCCTAGTCTCAGAC CTTCCCA‑3’； 所述探针组包括： NTM‑fast‑P： 5’ ‑CRGCGACGT TACGCAGAC CTTCC‑3’ NTM‑slow‑P1： 5’ ‑CCGTGGCCGTCGTCGTGC ‑3’ NTM‑slow‑P2： 5’ ‑CYGGCGACGGCACCACCACG‑3’ MTBC‑P： 5’ ‑CACAGCCCGTCCCGCCGA‑3’ IC‑P探针： 5’ ‑CCACGAGCTGAGTGCGTC CTGTC‑3； 还包括rpoB基因内参的引物： rpoB‑F:CAGACGT TGATCAACATCCG rpoB‑R： TACGGCGTTTCGATGAAC 还包括rpoB基因探针： rpoB‑P1‑516： TGGACCAGAACAACC rpoB‑P2‑526： ACCCACAAGCGCC rpoB‑P3‑531： CCAGCGCCGACAG 其中N代表碱基A/T/ C/G， Y代表碱基C/T， S代表碱基G/ C， K代表碱基G/T， R代 表碱基A/G； 其中探针组中每条探针的序列两端标记有荧光基团和淬灭基团， 且IC ‑P探针、 MTBC ‑P、 NTM‑fast‑P使用不同颜色的荧光基团， NTM ‑slow‑P1、 NTM‑slow‑P2使用的荧光基团颜色不 同于前述 IC‑P探针、 MTBC ‑P、 NTM‑fast‑P。 2.根据权利要求1所述的鉴别非结核、 结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物， 其特 征在于： 所述 荧光基团选自FAM、 H EX、 ROX、 C Y5； 所述淬灭基团选自BHQ1、 BHQ2。 3.根据权利要求2所述的鉴别非结核、 结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物， 其特 征在于： 所述NTM ‑fast‑P的荧光基团选用HEX， 所述MTBC ‑P的荧光基团选用FAM， 所述NTM ‑ slow‑P1、 NTM‑slow‑P2的荧光基团选用ROX， 所述IC ‑P探针的荧光基团选用CY5； 所述rpoB ‑ P1‑516探针的两端分别修饰FAM基团和BHQ1基团， 所述rpoB ‑P2‑526探针的两端分别修饰 HEX基团和BHQ1基团， 所述rpoB ‑P3‑531探针的两端分别修饰ROX基团和BHQ2基团。 4.一种鉴别非结核、 结核分枝杆菌及其利福平耐药性的试剂盒， 其特征在于含有权利 要求1‑3中任一项所述的组合物。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于所述的试剂盒包括A、 B两种反应体系， 其 中A体系包括分枝杆菌反应液1、 无酶水、 酶预混液、 阳性质控品1和阴性对照； B体系包括分权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115418407 A 2枝杆菌反应液2、 无酶水、 酶预混液、 阳性质控品2和阴性对照， 分枝 杆菌反应液1含有权利要 求1‑3中任一项所述的NTM引物和探针、 MTBC引物和探针及人源的引物组和探针组， 分枝杆 菌反应液2含有权利要求1 ‑3中任一项所述的rpoB基因内参的引物、 rpoB基因探针、 人源的 引物组和探针组。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于所述的试剂盒中的酶预混液引入了dUTP/ UDG防污染系统； 阴性对照为无酶水或DNA提取液， 阳性质控品1运用多片段重组方式构建成 质粒载体， 在LB培养基中培育得到具有阳性表达质粒的菌液， 通过QPCR检测和 定量稀释从 而获得结核及非结核阳性表达质粒， 制成阳性质控品1； 阳性质控品2为利福平敏感型结核 分枝杆菌标准质粒。 7.权利要求1 ‑3中任一项所述的组合物在鉴别非结核、 结核分枝杆菌及其利福平耐药 性中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115418407 A 3