(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210692876.1 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 扬州大学 地址 225000 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 李向东　余良政　侯闻闻　朱振邦　 刘盼娆　 (74)专利代理 机构 北京风雅颂专利代理有限公 司 11403 专利代理师 李翔 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 鉴别猪呼吸道疾病综合征原发性病原的 iiPCR试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明涉及动物病毒学技术领域， 具体涉及 一种鉴别猪呼吸道疾病综合征原发性病原的 iiPCR试剂盒及其使用方法， 试剂盒包括针对这 四种病原独立配置的iiPCR扩增液、 阳性对照和 阴性对照， 所述iiPCR扩增液包 括Premix缓冲液、 Taq DNA聚合酶、 MMLV反转酶和引物探针组等， 所 述引物探针组分别包括第一引物对和第一探针、 第二引物对和第二探针、 第三引物对和第三探 针、 第四引物对和第四探针。 本发明针对临床中 猪的淋巴结、 肺脏、 鼻拭子等样品， 经核酸提取， 可直接将DNA或者RNA作为模板， 即可完成iiPCR 检测。 权利要求书1页 说明书12页 序列表4页 CN 115011736 A 2022.09.06 CN 115011736 A 1.一种鉴别猪 呼吸道疾病综合征原发性病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 包括iiPCR 扩增液， 所述iiPCR扩增液包括Premix缓冲液、 Taq  DNA聚合酶、 MMLV反转酶和引物探针组， 所述引物探针组包括第一引物对和第一探针、 第二引物对和第二探针、 第三引物对和第三 探针、 第四引物对和第四探针， 所述第一引物对包括如SEQ  ID NO.1所示的PRRSV上游引物 和如SEQ ID NO.2所示的PRRSV下游引物， 所述第一探针包括如SEQ  ID NO.3所示的PRRSV探 针， 所述第二引物对包括如SEQ  ID NO.4所示的PRV上游引物和如SEQ  ID NO.5所示的PRV下 游引物， 所述第二探针包括如SEQ  ID NO.6所示的PRV探针， 所述第三引物对包括如SEQ  ID  NO.7所示的SIV上游引物和如SEQ  ID NO.8所示的SIV下游引物， 所述第三探针包括如SEQ   ID NO.9所示的SIV探针， 所述第四引物对包括如SEQ  ID NO.10所示的PCV2上游引物和如 SEQ ID NO.11所示的PCV 2下游引物， 所述第四探针包括如SEQ  ID NO.12所示的PCV 2探针。 2.根据权利要求1所述鉴别猪呼吸道疾病综合征原发性病原的iiPCR试剂盒， 其特征在 于， 所述试剂盒还 包括阳性对照和阴性对照。 3.根据权利要求2所述鉴别猪呼吸道疾病综合征原发性病原的iiPCR试剂盒， 其特征在 于， 所述阳性对照为进行灭活处理过的PRRSV、 PRV、 SIV、 PCV2病毒液， 接毒剂量为1 × 106TCID50/mL， 所述阴性对照为 Nuclease ‑free水。 4.根据权利要求1所述鉴别猪呼吸道疾病综合征原发性病原的iiPCR试剂盒， 其特征在 于， 所述试剂盒还 包括待测样品， 所述待测样品为猪的淋巴结、 肺脏或鼻拭子中的一种。 5.根据权利要求1所述鉴别猪呼吸道疾病综合征原发性病原的iiPCR试剂盒， 其特征在 于， 所述iiPCR扩增液用量为48μl， 添加模板量为2μl， iiPCR扩增液包括(Premix缓冲液) dNTP、 Tris ‑Buffer、 EDTA、 DTT、 甘油和Tween ‑20， 含量分别为0.5mM、 10mM、 0.05mM、 0.05mM、 30％V/V和0.1％V/V， Taq  DNA聚合酶的浓度0.1U/μl、 MMLV反转录酶的浓度为0.5U/μl， PRRSV上游引物、 PRV上游引物、 SIV上游引物、 PCV2上游引物、 PRRSV下游引物、 PRV下游引物、 SIV下游引物和P CV2下游引物的浓度均为 1 μM， 第一探针、 第二探针、 第三探针和第四探针的 浓度均为0.0 5 μM， 所述模板为猪的淋巴结、 肺脏或鼻拭子提取的核酸DNA或RNA。 6.根据权利要求1所述鉴别猪呼吸道疾病综合征原发性病原的iiPCR试剂盒， 其特征在 于， 所述第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针的5 ’端均使用FAM荧光报告基团， 3 ’端均 使用MGB荧 光淬灭基团。 7.根据权利要求1 ‑6任一项所述鉴别猪呼吸道疾病综合征原发性病原的iiPCR试剂盒 的使用方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤一、 取 试剂盒中的i iPCR扩增液分装至i iPCR反应管中， 瞬时离心； 步骤二、 取待检样品加入到步骤一准备好的iiPCR反应管中， 瞬时离心后置入iiPCR仪 器； 步骤三、 选择520nm单通道荧光波长进行检测， 待iiPCR仪器反应结束后， 读取判定结 果。 8.根据权利要求7所述鉴别猪呼吸道疾病综合征原发性病原的iiPCR试剂盒的使用方 法， 其特征在于， 所述 iiPCR仪器采用手持式POCKITTM Micro Duo核酸分析仪 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011736 A 2鉴别猪呼吸道疾病综合征原发性病原的i iPCR试剂盒及其使 用方法 技术领域 [0001]本发明涉及猪呼吸道症候群病毒技术领域， 尤其涉及一种鉴别猪猪呼吸道疾病综 合征原发性病原的i iPCR试剂盒及其使用方法。 背景技术 [0002]1998年， 在英国伯明翰召开的第15届国际猪病大会(International  Pig Veterinary  Society Congress,IPVSC)上， “猪呼吸道疾病综合征 ”(Porcine respiratory   disease complex,PRDC)这一概念首次被正式提出。 它指的是因不完善的生物安全体系或 者低下的饲养管理水平等不良因素诱 发， 由一种或者多种病原体单独或者混合感染所导致 的猪呼吸系统性疾病。 该病常发生于  6～10周龄的保育猪和13～20周龄的育肥猪， 患猪主 要表现为体温升高(40  ℃以上)、 食欲废绝、 呼吸困难、 咳嗽等症状， 发病率为25％～60％， 病死率为20％～90％。 保育猪周龄越小， 死亡率越高； 育肥猪死亡率低， 但 生长发育迟缓， 饲 料转化率降低， 这严重阻碍了国内养猪业的健康发展。 我国广西、 福 建、 黑龙江等地均已报 道了PRDC的发生。 当前， 能够引起 “猪呼吸道疾病综合征 ”的主要原发性病原体包括： 猪繁殖 与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive  and respiratory  syndrome,PRRSV)、 猪伪 狂 犬病毒(P seudorabies virus,PRV)、 猪流感病毒(Swine  influenza  virus,SIV)以及猪圆 环病毒 (Porcine circovirus,PCV)II型， 它们能够破坏呼吸系统的防御屏障， 抑制机体的 免疫功能， 最终导致更多继发性病原的感染。 往后， 随着我国生猪养殖产业规模化、 集约化 地发展， 临床 中类似PRDC等一系列猪病综合征很难通过大体剖检就足以确诊致病源， 因此 针对同一症候群下的不同病原开展精准的分子鉴别诊断是亟需且必要的。 [0003]猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine  reproductive  and respiratory  syndrome,   PRRSV)是一种单股正链RNA病毒， 可分为 欧洲型(基因I型)和美洲 型 (基因II型)两种 基因 型。 虽然， 欧洲型PRRSV在我国某些省份有被检出过， 但是绝大多数毒株都呈现出偶发或者 散发的特征。 1996年， 中国首次报道了美洲型PRRSV的出现， 随后在国内各主要养猪地区均 存在该类病毒的流行。 2006年以来， 我国相继出现了高致病性的PRRSV毒株、 类NADC30  毒 株、 类NADC34毒株、 RFLP  1‑4‑4Lineage  1C毒株等优势 变异株。 PRRSV  具有复杂的遗传多样 性， 病毒基因组中的ORF5和Nsp2是两个较为高变的区域。 基于ORF5基因的系统发生树分析 法将美洲型PRRSV分为Lineage  1 ～9分支谱系， 在中国主要流行的是Lineage  1(代表毒 株： 类NADC30、 类  NADC34)、 Lineage  3(代表毒株QYYZ、 GM2)、 Lineage  5(代表毒株   VR2332)、 Lineage  8(代表毒株CH ‑1a)、 Lineage  9(代表毒株： XJNJ)  等谱系毒株。 此外， 我 国疫苗毒株与流行毒株以及流行毒株之 间常发生重组事件， 致使田间毒株生物学特性复杂 多变。 [0004]猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies  Virus,PRV)是一种线性双链DNA病毒，  PRV只有 一个血清型， 但 不同毒株之间毒力有所差异。 20世纪60年代以后， 随着PRV强毒株的出现， 猪 伪狂犬病在世界范围内频繁暴发， 我国为了控制PRV的流行， 1979年