(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210705079.2 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 青岛海水稻研究发展中心有限公司 地址 266041 山东省青岛市李沧区金 水路 171号16号楼 (72)发明人 刘佳音　李儒剑　万吉丽　尹晓佳　 李霞　于萌　殷会德　顾晓振　 米铁柱　栾一方　王平　 (74)专利代理 机构 山东三邦知识产权代理事务 所(普通合伙) 37308 专利代理师 牛继梅 (51)Int.Cl. C12N 15/54(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2018.01)A01H 6/46(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) (54)发明名称 通过定点基因敲除选育糯性水稻突变体的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种通过定点基因敲除选育 糯性水稻突变体的方法， 属于作物遗传育种技术 领域。 本发 明通过定点基因敲除选育糯性水稻突 变体的方法是将基于CRISPR/Cas9的定点基因敲 除选育糯性水稻的重组载体转化到水稻中， 鉴定 阳性转化植株， 进一步筛选基因敲除植株， 并剔 除转基因成分， 即得糯性水稻突变体。 本发明的 方法高效， 经过改良的水稻材料均表现糯性， 为 水稻育种提供了新的种植资源。 权利要求书3页 说明书13页 序列表8页 附图4页 CN 114958879 A 2022.08.30 CN 114958879 A 1.一种基于CRISPR/Cas9的定点基因敲除选育糯性水稻的重组载体， 其特征在于， 针对 水稻Waxy基因的核酸序列， 设计3个敲除靶点， 分别构建3个启动子 ‑靶点‑sgRNA序列， 将 3个 启动子‑靶点‑sgRNA序列依次连接到Cas9载体中， 即为基于CRISPR/Cas9的定点基因敲除选 育糯性水稻的重组载体； 其中， 所述水稻Waxy基因的核酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述3个启动子 ‑靶点‑sgRNA序列分别为启动子1 ‑靶点1‑sgRNA序列、 启动子2 ‑靶点2‑ sgRNA序列、 启动子 3‑靶点3‑sgRNA序列； 在启动子1 ‑靶点1‑sgRNA中， 启动子序列如SEQ  ID NO:2所示， 靶点序列如SEQ  ID NO:3 所示； 在启动子2 ‑靶点2‑sgRNA中， 启动子序列如SEQ  ID NO:4所示， 靶点序列如SEQ  ID NO:5 所示； 在启动子3 ‑靶点3‑sgRNA中， 启动子序列如SEQ  ID NO:6所示， 靶点序列如SEQ  ID NO:7 所示； 上述3个启动子 ‑靶点‑sgRNA序列的sgRNA相同， 其序列如SEQ  ID NO:8所示。 2.权利要求1所述基于CRISPR/Cas9的定点基因敲除选育糯性水稻的重组载体的构建 方法， 其特 征在于， 步骤如下： (1)以水稻基因组DNA为模板， 分别克隆水稻U3、 U6a、 U6b启动子序列， 即启动子1、 启动 子2、 启动子3的序列， 将上述3个启动子序列分别 连接到克隆载体中， 获得克隆载体 ‑U3、 克 隆载体‑U6a、 克隆载体 ‑U6b； (2)通过两条包含互补序列的长引 物退火延伸获得sgRNA序列， 将sgRNA序列连接到克 隆载体中， 获得 克隆载体 ‑sgRNA； (3)分别以上述克 隆载体‑U3、 克隆载体‑U6a、 克隆载体 ‑U6b、 克隆载体‑sgRNA为模板， 对启动子1 ‑靶点1‑sgRNA、 启动子2 ‑靶点2‑sgRNA、 启动子3 ‑靶点3‑sgRNA的启动子 ‑靶点序 列和靶点 ‑sgRNA序列进行扩增， 以扩增获得的启动子 ‑靶点序列和靶点 ‑sgRNA序列为模板， 通过overlap  PCR方法， 获得启动子1 ‑靶点1‑sgRNA、 启动子2 ‑靶点2‑sgRNA、 启动子3 ‑靶点 3‑sgRNA的序列； (4)对获得的启动子1 ‑靶点1‑sgRNA、 启动子2 ‑靶点2‑sgRNA、 启动子3 ‑靶点3‑sgRNA的 序列和Cas9载体序列进行酶切， 将启动子1 ‑靶点1‑sgRNA、 启动子2 ‑靶点2‑sgRNA、 启动子3 ‑ 靶点3‑sgRNA依次连接到Cas9载体中， 即为基于CRISPR/Cas9的定点基因敲除选育糯性水稻 的重组载体。 3.根据权利要求2所述基于CRISPR/Cas9的定点基因敲除选育糯性水稻的重组载体的 构建方法， 其特 征在于， 克隆水稻U3、 U6a、 U6b启动子序列的引物对分别如SEQ  ID NO:9‑SEQ ID NO:10、 SEQ  ID  NO:11‑SEQ ID NO:12、 SEQ  ID NO:13‑SEQ ID NO:14所示； 扩增sgRNA序列的两条引物序列如SEQ  ID NO:15‑SEQ ID NO:16所示； 所述启动子1 ‑靶点1‑sgRNA的启动子 ‑靶点序列和靶点 ‑sgRNA序列 的扩增引物如SEQ   ID NO:17‑SEQ ID NO:18和SEQ  ID NO:19‑SEQ ID NO:20所示； 所述启动子2 ‑靶点2‑sgRNA的启动子 ‑靶点序列和靶点 ‑sgRNA序列 的扩增引物如SEQ   ID NO:21‑SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23‑SEQ ID NO:24所示；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114958879 A 2所述启动子3 ‑靶点3‑sgRNA的启动子 ‑靶点序列和靶点 ‑sgRNA序列 的扩增引物如SEQ   ID NO:25‑SEQ ID NO:26和SEQ  ID NO:27‑SEQ ID NO:28所示。 4.权利要求2或3所述方法构建的载体在定点基因敲除选 育糯性水稻中的应用。 5.一种通过定点基因敲除选育糯性水稻突变体的方法， 其特征在于， 将权利要求1所述 的重组载体转化到水稻中， 鉴定阳性转化植株， 进一步筛选基因敲除植株， 并剔除转基因成 分， 即得糯性水稻突变 体。 6.根据权利要求5所述通过定点基因敲除选育糯性水稻突变体的方法， 其特征在于， 所 述重组载体的构建方法如下： (1)以水稻基因组DNA为模板， 分别克隆水稻U3、 U6a、 U6b启动子序列， 即启动子1、 启动 子2、 启动子3的序列， 将上述3个启动子序列分别 连接到克隆载体中， 获得克隆载体 ‑U3、 克 隆载体‑U6a、 克隆载体 ‑U6b； (2)通过两条包含互补序列的长引 物退火延伸获得sgRNA序列， 将sgRNA序列连接到克 隆载体中， 获得 克隆载体 ‑sgRNA； (3)分别以上述克 隆载体‑U3、 克隆载体‑U6a、 克隆载体 ‑U6b、 克隆载体‑sgRNA为模板， 对启动子1 ‑靶点1‑sgRNA、 启动子2 ‑靶点2‑sgRNA、 启动子3 ‑靶点3‑sgRNA的启动子 ‑靶点序 列和靶点 ‑sgRNA序列进行扩增， 以扩增获得的启动子 ‑靶点序列和靶点 ‑sgRNA序列为模板， 通过overlap  PCR方法， 获得启动子1 ‑靶点1‑sgRNA、 启动子2 ‑靶点2‑sgRNA、 启动子3 ‑靶点 3‑sgRNA的序列； (4)对获得的启动子1 ‑靶点1‑sgRNA、 启动子2 ‑靶点2‑sgRNA、 启动子3 ‑靶点3‑sgRNA的 序列和Cas9载体序列进行酶切， 将启动子1 ‑靶点1‑sgRNA、 启动子2 ‑靶点2‑sgRNA、 启动子3 ‑ 靶点3‑sgRNA依次连接到Cas9载体中， 即为基于CRISPR/Cas9的定点基因敲除选育糯性水稻 的重组载体。 7.根据权利要求6所述 通过定点基因敲除选 育糯性水稻突变 体的方法， 其特 征在于， 克隆水稻U3、 U6a、 U6b启动子序列的引物对分别如SEQ  ID NO:9‑SEQ ID NO:10、 SEQ  ID  NO:11‑SEQ ID NO:12、 SEQ  ID NO:13‑SEQ ID NO:14所示； 扩增sgRNA序列的两条引物序列如SEQ  ID NO:15‑SEQ ID NO:16所示； 所述启动子1 ‑靶点1‑sgRNA的启动子 ‑靶点序列和靶点 ‑sgRNA序列 的扩增引物如SEQ   ID NO:17‑SEQ ID NO:18和SEQ  ID NO:19‑SEQ ID NO:20所示； 所述启动子2 ‑靶点2‑sgRNA的启动子 ‑靶点序列和靶点 ‑sgRNA序列 的扩增引物如SEQ   ID NO:21‑SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23‑SEQ ID NO:24所示； 所述启动子3 ‑靶点3‑sgRNA的启动子 ‑靶点序列和靶点 ‑sgRNA序列 的扩增引物如SEQ   ID NO:25‑SEQ ID NO:26和SEQ  ID NO:27‑SEQ ID NO:28所示。 8.根据权利要求5所述通过定点基因敲除选育糯性水稻突变体的方法， 其特征在于， 所 述剔除转基因成分是收获转基因植株T0代种子， 将种子置于含50mg/L潮霉素的蒸馏水中， 28℃黑暗条件 下催芽， 剔除具有潮霉素抗性的种子； 剩余的种子移栽至大田， 幼 苗成活后取 叶片提取DNA， 通过PCR检测Cas9基因和HPT基因， 经检测Cas9基因和HPT基因未出现扩增的 植株即为 最终选育的不含有转基因成分的糯性 突变体。 9.根据权利要求8所述通过定点基因敲除选育糯性水稻