(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210602845.2 (22)申请日 2022.05.31 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114672483 A (43)申请公布日 2022.06.28 (73)专利权人 上海百力格生物技 术有限公司 地址 201611 上海市松江区书 海路99号23 幢 (72)发明人 葛云龙　苏敏　蔡晶晶　李俊　 (74)专利代理 机构 北京玄法律师事务所 16 002 专利代理师 潘满根 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01)(56)对比文件 CN 104189 924 A,2014.12.10 WO 02067857 A2,2002.09.06 KR 20050115919 A,20 05.12.08 刘钟瑸等. “化学法标记生物素核酸探 针的 实验研究 ”. 《中国免疫学杂志》 .19 90,第6卷(第4 期), Tuan Vo-Di nh et al. .“Single-cell monitoring using ”fiberoptic nan osensors. 《Nanomed Nan obiotechnol》 .2011,第3卷 郁美娟等. “基于生命体系中氨基 键合标记 的荧光探针研究进展”. 《染料与染色》 .20 04,第 41卷(第3期), 审查员 卢文倩 (54)发明名称 超声法核酸探 针制备方法 (57)摘要 本发明提供一种超声法核酸探针制备方法， 所述制备方法中带有氨基活性基团核酸与可与 氨基基团反应的活化酯修饰染料两者在30 ‑50℃ 碱性缓冲溶液中超声反应制备得到核酸探针。 本 发明在生产过程中只需5min即可反应完成， 极大 的提高了反应速率， 极大的缩短了反应周 期； 同 时本发明大 大提高了修饰染料原材 料的利用率。 权利要求书1页 说明书17页 CN 114672483 B 2022.09.02 CN 114672483 B 1.一种超声法核酸探针制备方法， 其特征在于， 所述制备方法中带有氨基活性基团核 酸与可与 氨基基团反应的活化酯修饰染料两者在30 ‑50℃碱性缓冲溶液中超声反应制备得 到核酸探针， 所述超声反应的频率 为35~50KHZ； 所述活化酯修饰染料 是琥珀酰 亚胺活化酯或异硫氰酸活化酯修饰染料； 所述超声反应的时间为5 ‑15分钟； 所述带有氨基活性基团核酸与所述可与氨基基团反应的活化酯修饰染料比例为1:1 ‑ 1:4； 所述活化酯修饰染料用有机溶剂溶解。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法中带有氨基活性基团核 酸与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料两者在45℃碱性缓冲溶液中超声反应制备得到 核酸探针。 3.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述核酸 为DNA或/和RNA。 4.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述超声反应的时间为5 ‑10分钟。 5.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述超声反应的频率 为40KHZ。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 所述带有氨基活性基团核酸与所述可与氨基基团 反应的活化酯修饰染料比例为1:2。 7.根据权利要求1所述的制备 方法， 所述碱性缓冲溶 液pH为7.1 ‑10.0。 8.根据权利要求7所述的制备方法， 所述碱性缓冲溶液是pH为8.5的N a2CO3/NaHCO3缓冲 液。 9.根据权利要求1 ‑8任一所述的制备方法， 在所述超声反应后， 向所述缓冲溶液中加入 酒精沉淀， 然后离心， 去除上清液， 取沉淀； 用酒精洗涤沉淀， 得到修饰的核酸探针粗品。 10.根据权利要求9所述的制备方法， 将所述核酸探针粗品用超纯水溶解， 装载至高效 液相色谱仪上 纯化， 拿到纯的核酸探针。 11.根据权利要求10所述的制备 方法， 所述核酸中碱基数不少于2 2个。 12.根据权利要求1 1所述的制备 方法， 所述核酸中碱基数不少于46个。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672483 B 2超声法核酸探针制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技 术领域， 特别涉及一种超声法核酸探针制备 方法。 背景技术 [0002]单链DNA与RNA是由一定数量的脱氧核苷酸或者核苷酸 组合而成。 而对D NA或者RNA 的结构进行一些改造， 就形成了DNA修饰探针以及RNA修饰探针。 DNA修饰探针与RNA修饰探 针广泛应用在分子诊断QPCR （实时荧光定量） 、 STR （短串联重复序列） 、 以及FISH （荧光原位 杂交技术） 等领域。 [0003]一般地， 有两种常见的方法可用于单链DNA与RNA的改造。 一种为固相 亚磷酰胺三 酯法， 另一种为液相氨基活化酯加成法。 传统的液相氨基活化酯加成法是把含有氨基活性 基团的DNA或RNA溶解在碱性的缓冲液中， 然后加入3倍摩尔量的有机溶剂溶解的活化酯修 饰染料， 在常温反应4 ‑12小时， 然后加入酒精进行沉淀， 同时用酒精对沉淀物进行反复洗 涤， 拿到沉淀固体， 然后用水溶解， 最后经高效液相色谱仪纯化得到纯的DNA修饰探针或RNA   修饰探针。 [0004]液相氨基活化酯加成法， 需要在DNA或者RNA 上合成氨基结构 （NH2） ， 同时需要活化 酯修饰染料为琥珀酰亚胺活化酯结构， 见下反应式 （1） ， 这种活化酯结构， 相比较亚磷酰胺 结构， 容易合成。 [0005] [0006]液相氨基活化酯加成法的具体操作的方案如下： [0007]（1） 将100nmol含有氨基结构的DNA/RNA溶解于100ul  pH为8.5的0.5MNa2CO3/ NaHCO3 缓冲液中， 充分震荡混匀。 [0008]（2） 用37.5ulDMF溶剂去溶解300nmol琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体， 并加入至 上述缓冲液中， 室温震荡混匀。 [0009]（3） 将上述溶 液放入摇床， 震荡4 ‑12小时。 [0010]（4） 在上述溶液中加入2mL酒精， ‑20℃冷冻30分钟出现絮状沉淀， 12000转高速离 心， 去除上清液， 取沉淀 。 [0011]（5） 用2ml   ‑20℃冷冻酒精 清洗沉淀 3遍， 并将沉淀烘干， 得DNA/RNA修饰探针粗品。 [0012]（6） 用1mL超纯水将干燥后的DNA/RNA修饰探针粗品溶解， 装载至高效液相色谱仪说　明　书 1/17 页 3 CN 114672483 B 3