(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210957476.9 (22)申请日 2022.08.10 (71)申请人 中国农业科 学院郑州果 树研究所 地址 450009 河南省郑州市管城回族区港 湾路28号 (72)发明人 李娜　马双武　周丹　李楠楠　 孔胜楠　尚建立　王吉明　 (74)专利代理 机构 郑州盈派知识产权代理事务 所(普通合伙) 41196 专利代理师 张晓辉　樊羿 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 西瓜种皮厚度紧密连锁SNP分子标记及其应 用 (57)摘要 本发明公开了一种西瓜种皮厚度紧密连锁 的SNP分子标记及其应用， 旨在解决对西瓜果种 皮厚度基因缺乏识别、 鉴定方法的技术问题。 本 发明提供了一种西瓜种皮厚度紧密连锁的SNP位 点 （西瓜基因组6号染色体第7046144bp处碱基由 T突变为C）， 基于SNP位点的酶切信息设计了 dCAPS分子 标记引物N6 ‑32。 应用该标记进行分子 标记辅助选择育种， 能以更快速、 准确的进行西 瓜种皮厚度的定向遗传改良； 通过简便的实验操 作和分析即可快速鉴定西瓜果实大小， 为西瓜种 皮厚度性状的检测提供了快速、 简便、 科学实用 的检测鉴定技 术。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 115369183 A 2022.11.22 CN 115369183 A 1.一种西瓜种皮厚度紧密连锁SNP分子标记， 其特征在于， 基于西瓜97103参考基因组 V2版， 位于 6号染色体704614 4bp处的碱基由厚种皮性状的T突变为薄种皮性状的C 。 2.一种检测试剂盒， 其特 征在于， 包括 NlaIII限制性内切酶及 如下引物N6 ‑32： 正向引物N6 ‑32F： 5’ ‑  TAATAGGGAAGAGTAGAG GG  ‑3’； 反向引物N6 ‑32R： 5’ ‑  TAAACCAAACACAAGCCAT  ‑3’； 。 3.权利要求1所述SNP分子标记或权利要求2所述检测试剂盒在西瓜种皮厚薄品种/系 选育中的应用。 4.一种鉴定西瓜种皮厚度基因型的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： （1） 提取待鉴定西瓜总DNA后， 以权利要求2中所述引物N6 ‑32进行PCR扩增： （2） 以限制性内切酶N laIII酶切上步所 得PCR产物； （3） 对所得酶切产物进行电泳图谱分析， 基于所述扩增产物的条带大小及位置关系确 定所属基因型， 其中， 出现单一条带391bp或两条带391bp与375bp则为厚种皮基因型， 出现 单一条带375bp则为薄种皮基因型。 5.根据权利要求4所述的鉴定西种皮厚度基因型的方法， 其特征在于， 在所述步骤 （1） 中， 利用植物基因 组DNA提取 试剂盒TIANGEN 提取待鉴定西瓜叶片总DNA。 6.根据权利要求4所述的鉴定西瓜种皮厚度基因型的方法， 其特征在于， 在所述步骤 （1） 中， PCR扩增体系为： 西瓜叶片总DNA  1 μL、 所述正向引物N6 ‑32F 1 μL、 所述反向引物N6 ‑ 32R 1 μL、 2× Power Taq PCR MasterMix  12.5 μL、 ddH2O 9.5 μL； 扩增程序为： 9 4℃ 5 min， 35个循环的94℃  30s、 52℃ 30s、 72℃3 0 s， 72℃ 10min。 7.根据权利要求4所述的鉴定西瓜种皮厚度基因型的方法， 其特征在于， 在所述步骤 （2） 中， 酶切反应体系为： PCR产物2 μl， NlaIII限制性内切酶0.2 μl， 10 ×buffer 1μl， ddH2O  6.8 μl； 反应程序为： 37℃恒温处 理10h， 65℃灭活20mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115369183 A 2西瓜种皮厚度紧密连锁SNP分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及西瓜分子标记辅助 育种领域技术领域， 具体涉及一种西瓜种皮厚度紧 密连锁SNP分子标记及其应用。 背景技术 [0002]西瓜 （Citrullus  lanatus） 是世界十大水果之一， 因其汁多味美， 富含瓜氨酸、 类 胡萝卜素、 番茄红素等对人体有益的功 能营养成分而成为深受人们喜爱的时令水果。 然而 西瓜果实中的籽粒影响食用体验； 因而西 瓜种子性状， 如种子大小和数量， 皆是西 瓜新品种 选育时重点考察的性状。 选育种子小、 种子数量少的品种有利于提高西 瓜果瓤的食用率， 且 方便消费者食用。 目前主要基于染色体加倍技术而创制的无籽西 瓜种子存在明显的 “三低” 问题 （李涵等， 2014） ， 加上其果实成熟普遍较晚、 需配授粉品种 等缺点， 制约了无籽西瓜在 生产上的全面推广。 如能培育出种子可食用的软籽西瓜， 像软籽石榴一样咀嚼后吞咽没有 障碍， 无需吐籽， 将是西瓜育种的一个重大突破。 [0003]另一方面， 西瓜种子是优质的蛋白质和植物油资源(王晓娟， 20 12)， 对人体有重要 的保健功能。 对于鲜食西瓜而言， 厚的种皮是种子的天然保护屏障， 但也是种子不能直接食 用的主要原 因。 黏籽西瓜 （ Citrullus  Mucosospermus ） 是与现代栽培西瓜亲缘关系最近的 种群 （Guo et al., 2019） ， 部分种质种 子外仅包裹着浅黄褐 色近乎透明的种皮， 种皮厚度 仅为普通西瓜种皮厚度的1/3。 如能获得可用于辅助育种的分子标记辅助薄种皮品种的选 育， 将薄种皮种子和果肉一起作为食用对象， 最 终实现吃瓜不吐籽的创新育种目标 （软籽西 瓜） ， 具有重要的科学与现实意义。 因此， 亟待开 发一种与西 瓜种皮厚度紧密连锁的、 易于操 作的、 鉴定效率高的、 成本较低的分子标记， 以期可为西 瓜种皮厚度基因精细定位和分子鉴 定研究提供高效的技 术手段。 [0004]公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解， 而不应当 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域 技术人员所公知的现有技 术。 发明内容 [0005]鉴于以上技术问题中的至少一项， 本公开提供了一种西瓜种皮厚度紧密连锁的 SNP位点 （基于西瓜97103参考基因组序列V2版， 西瓜基因组6号染色体第7046144bp处碱基 由T突变为C） ， 基于SNP位 点的酶切信息设计了dCAP S分子标记引物N6 ‑32。 [0006]根据本公开的一个方面， 提供一种西瓜果种皮厚度基因紧密连锁的SNP分子标记， 基于西瓜97103参考基因组V2版， 位于6号染色体7046144bp处的碱基由厚种皮性状的T突变 为薄种皮性状的C 。 [0007]根据本公开的另一个方面， 提供一种检测试剂盒， 包括NlaIII限制 性内切酶及如 下引物N6 ‑32： 正向引物N6 ‑32F： 5’ ‑  TAATAGGGAAGAGTAGAG GG  ‑3’； 反向引物N6 ‑32R： 5’ ‑  TAAACCAAACACAAGCCAT  ‑3’。说　明　书 1/6 页 3 CN 115369183 A 3