(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210739324.1 (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 广州医科 大学附属第三医院 （广州 重症孕产妇救治中心、 广州柔济医 院） 地址 510000 广东省广州市荔湾区多宝路 63号 (72)发明人 洪宏海　李巧玉　尹萍　张宗桃　 陈妍　杨瑾仪　唐毅　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 专利代理师 沈晓彦 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 血清中hsa_circ_0044235水平作为乳腺癌 诊断标志 物的应用 (57)摘要 本发明公开了血清中hsa_circ_0044235水 平作为乳腺癌诊断标志物的应用， 涉及生物医学 技术领域。 本发明要求保护检测hsa_circ_ 0044235表达的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中 的应用。 本发 明还要求保护一种乳腺癌的诊断试 剂盒， 包含检测hsa_circ_0044235表达的试剂。 本发明提供的乳腺癌诊断标志物在正常人血清 中呈高表达， 在乳腺癌病人血清中呈低表达； 采 用ROC曲线分析证明， 该标志物对乳腺癌诊断具 有良好价值。 权利要求书1页 说明书10页 序列表1页 附图3页 CN 114921558 A 2022.08.19 CN 114921558 A 1.检测hsa_circ_0 044235表达的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特 征在于， 所述产品为检测试剂或试剂盒。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 检测hsa_circ_0044235表达的方法具体包 括： (1)提取人血清样本中的总RNA， 逆转录得到 cDNA； (2)以所述cDNA为模板， 采用如SEQ  ID NO.1‑2所示的引物对， 如SEQ  ID NO.3所示的探 针， 进行d dPCR检测。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述ddPCR检测的反应体系为： 2X  ddPCR  Supermix for probes 10 μL， 20X探针‑引物混合物1 μL， 无 RNA酶水8 μL， 模板cDNA  1 μL； 所述 20X探针‑引物混合物的配制体系为： 50 μM上游引物36 μL， 50 μM下游引物36 μL， 100 μM探针5 μ L， 无RNA酶水23 μL。 5.根据权利要求3所述的应用， 其特 征在于， 所述d dPCR检测延伸阶段的温度为52.9℃。 6.一种诊断乳腺癌的引物组， 其特征在于， 包括如SEQ  ID NO.1所示的上游引物和如 SEQ ID NO.2所示的下游引物。 7.一种乳腺癌的诊断试剂盒， 其特 征在于， 包 含检测hsa_circ_0 044235表达的试剂。 8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒， 其特征在于， 所述诊断试剂盒包含权利要求6所 述的引物组。 9.根据权利要求8所述的诊断试剂盒， 其特征在于， 所述诊断试剂盒还包含如SEQ  ID  NO.3所示的探针。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921558 A 2血清中hsa_circ_0 044235水平作为乳腺癌诊断标志物的应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物医学技术领域， 特别是涉及血清中hs a_circ_0044235水平作为乳 腺癌诊断标志 物的应用。 背景技术 [0002]乳腺癌是常见的肿瘤， 早发现、 早诊断对于降低乳腺癌死亡率、 提高患者生存率至 关重要。 近年来， 虽然乳腺癌诊断技术提高， 但由于缺乏特异性的生物标志物， 确诊发现时 多为中晚期阶段， 乳腺癌的早期诊断仍 面临着巨大挑战。 [0003]现有乳腺癌辅助检测的缺陷： [0004]①影像学检查： 例如钼靶X线、 B超等检查， 虽然于可定位肿瘤位置、 大小， 发现钙 化 灶。 但不能明确肿瘤良恶性质， 且不可实时监测， 有相对滞后性； 对医生和设备要求较高。 [0005]②病理学检查： 明确病理性质 “金标准”， 但有研究表明： 肿瘤存在 “异质性”， 依赖 单位点取样的活检方式可能会错过特定部位的突变,况且该异质性也存在于转移瘤 间， 即 使来自于同一肿瘤不同部位的转移瘤 间也存在差异， 所以具有漏检的可能。 其次病理检查 痛感强烈、 创伤性大， 患者依从性稍差， 也达不到对 疾病的动态检测。 [0006]③现有的蛋白分子检测： 目前临床常用CEA、 CA125、 CA153等分子标志物用于乳腺 癌的辅助检测， 但其特异 性差、 灵敏度低， 往往需要 联合检测， 无形中增加了患者经济负担。 例如： CA153缺乏足够的灵敏度和特异性， 在早期乳腺癌病人血清中升高并不明显， 主要用 于预后评估、 术后的病情监测 和疗效评估等。 [0007]④与现有核酸检测技术相比： 临床上用作核酸检测的技术主要依赖于qRT ‑PCR技 术。 虽然其检测灵敏度已较高， 但在检测低拷贝含量的核酸或者单基因突变时仍然具有一 定局限性， 且依赖标准曲线定量。 [0008]数字PCR(droplet  digital PCR,ddPCR)是一种灵敏度高、 特异性强的检测方式。 基于泊松分布和样本极度稀释的原理， 以油包水 的形式将样本极度稀释到单分子水平， 即 每个微滴包含1或0个核酸分子。 微滴形式保证了每个核酸分子扩增具有独立性， 互不影响。 然后进行热循环， 产生放大效应。 荧光信号只存在于含有目标分子的液滴中， 通过快速微流 分析每个微滴的荧光信号， 最终达 到对目标分子绝对定量检测。 [0009]有研究表明， 当目的基因小于103个拷贝时， 实时荧光定量PCR(qPCR)检测性能显 著降低。 但ddPCR不同， 它以微滴形式扩增可以达到对目的基因的绝对定量， 较qPCR检测更 加灵敏、 准确度更高， 更加适 合低浓度、 低拷贝的核酸检测， 且不依赖标准曲线。 [0010]近年来以“液体活检 ”为基础的检测研究越来越热， 其中循环肿瘤细胞、 非编码核 苷酸等检测对疾病早期检测、 病情监控、 疗效评评估等 发挥着巨大作用。 例如： 自2013年2月 Rajewsky教授及其团队发现具有里程碑意义的circRNAciRS ‑7(CDR1as)可作为微小RNA ‑7 (miR‑7)的分子海绵以来， circRNA成为肿瘤机制研究的新热点， 也是血清学检测的新型标 志物， 查阅近年来文献， 有研究发现hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276可能是早期胃 癌预测因子； 但在乳腺癌 领域研究中， 以hsa_circ_0044235作为血清检测标志物尚未有文说　明　书 1/10 页 3 CN 114921558 A 3