(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210752591.2 (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 河南省农业科 学院 地址 450002 河南省郑州市金 水区花园路 116号 (72)发明人 张新友　孙子淇　齐飞艳　郑峥　 刘华　秦利　黄冰艳　石磊　 苗利娟　张忠信　徐静　田梦迪　 赵瑞芳　董文召　 (74)专利代理 机构 郑州市华翔专利代理事务所 (普通合伙) 41122 专利代理师 张爱军 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 花生内种皮颜色调控基因A hLAC功能的分子 标记与应用 (57)摘要 本发明提供一种花生内种皮颜色调控基因 AhLAC功能的分子标记与应用， 所述分子标记为 A05.114993389， 位于花生第5号染色体的114, 993,389bp处， 所述分子 标记位点为InDel插入 缺 失标记。 本发明基于花生内种皮颜色调控基因 AhLAC的序列的突变类 型， 开发了A 05.11499 3389 (InDel位点)的KASP分子标记， 该标记在花生自 然群体材料中的分型结果与内种皮颜色完全连 锁， 证明了该标记的准确性。 该KASP标记能够快 速准确的获得花生材料内种皮颜色信息， 且能应 用于花生分子辅助标记育种中。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图3页 CN 115011728 A 2022.09.06 CN 115011728 A 1.花生内种皮颜色调控基因AhLAC的功能分子标记， 其特征在于， 所述分子标记为 A05.114993389， 位于花生第5号染色体的114,993,389bp处， 所述分子标记位点为InDel插 入缺失标记； 其中， 野生型的分子标记位 点前后20 0bp的序列为： CCTGGTGACTTTTTTCCTTGCTCAAGAGAAGGTATGCTGTATGCATGAAGATTTCATTTCAAGCATGCTCAA ATGTTCTTTGATTTTA GAATCTCTAACTGCATCAATTCTTTTTGTTTTTTCACA GAAACATTCAA GTTTAATGTA G ATTTTGGCAA GACTTATCTGCTGA GGATTGTGAATGCTGCAATGAATGTA GTTCTCTTTTTCTCTGTTTACAAACA CAGTCTCACTGTTGTTGGTGCTGATGCTGCCTACACCGA GCCATTAACAA GAGACTTCATATGCATA GCTCCAGGA CAATCACTTGATGTTTTGTTGCATGCAAATCAA GAACCTGATCACTATTACATGGCTGCAA GAGCATATTCAA GTT CCTCTATTCTTCCTTTTGATAACA； 突变型为插入214bp序列， 方括号内是插入的214bp序列， 其分子标记位点前后200bp的 序列为： CCTGGTGACTTTTTTCCTTGCTCAAGAGAAGGTATGCTGTATGCATGAAGATTTCATTTCAAGCATGCTCAA ATGTTCTTTGATTTTA GAATCTCTAACTGCATCAATTCTTTTTGTTTTTTCACA GAAACATTCAA GTTTAATGTA G ATTTTGGCAA GACTTATCTGCTGA GGATTGTGAATGCTGCAATGAATGTA GT[TCTCTTTTTGGCAACTACTCCTA TGAAGATGCCAAAAACATCTTTTTATGATGATCTTTGTTTAAAAA GTGTAACTTATTTGTTTAGCAACACTTTAAA TAAAGATAACACTTTTACTTTAAATAAAATCAAACCCTACAATCTATCATCTAATGGTCAAAATGAAATATCTTCA TATGATGACAATCATAAAATCTTCATTGGA GTAGCCACC]TCTCTTTTTCTCTGTTTACAAACACA GTCTCACTGT TGTTGGTGCTGATGCTGCCTACACCGA GCCATTAACAAGA GACTTCATATGCATA GCTCCAGGACAATCACTTGAT GTTTTGTTGCATGCAAATCAA GAACCTGATCACTATTACATGGCTGCAA GAGCATATTCAA GTTCCTCTATTCTTC CTTTTGATAACA。 2.用于扩增如权利 要求1所述的功能分子标记的KASP引物 组合， 其特征在于， 所述KASP 引物组合包括： qIIC_A05_F1:5’ ‑GCTCAGAGA AAAAGAGAACTACATTC‑3’， qIIC_A05_F2:5’ ‑ATTGACCATTAGATGATAGAT TGTAG‑3’， qIIC_A05_com:5’ ‑CAAGAGAAGGTATGCTGTATGCA ‑3’。 3.利用如权利要求1所述的功能分子标记鉴定花生内种皮颜色的方法， 其特征在于， 包 括： (1)提取待鉴定花生样本的DNA， 利用权利要求2所述KASP引物组合检测待鉴定花生样 本的基因型数据， 通过SNPLine基因分型平台对待鉴定花生样本的A05.114993389的InDel 位点进行基因分型； (2)若A05.114993389位点的分型结果为突变型(MITE:MITE)时， 则待鉴定花生样本内 种皮颜色表现为白色； 若A05.114993389位点的分型结果为野生型( ‑:‑)时， 则待鉴定花生 样本内种皮颜色表现为黄色。 4.如权利 要求3所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)鉴定时采用PCR技术， PCR扩增程 序为： 94℃ 预变性15min； 94℃变性20s， 61℃ ‑55℃延伸1min， 10个循环； 94℃变性20s， 55℃ 延伸1min， 26个循环； 10℃保存。 5.如权利要求1所述的功能分子标记在花 生内种皮颜色鉴定中的应用。 6.如权利要求1所述的功能分子标记在花 生分子育种中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011728 A 2花生内种皮颜色调控基因A hLAC功能的分子标记与应用 技术领域 [0001]本发明涉及花生内种皮颜色调控基因AhLAC功能分子标记的开发与应用， 属于分 子生物学 领域。 背景技术 [0002]花生(Arachis  hypogaea  L.； 2n＝4x＝40)是重要的油 料作物， 其世界总产量达 4765万吨， 仅次于大豆、 油菜和向日葵。 花青素的组成是决定花生种皮颜色的因素。 花青素 作为植物 次生代谢物质， 广泛存在于开花植物中， 是一种安全的抗氧化剂， 还有保护视力、 阻碍蛋白糖化等保健价值。 随着人们保健意识的增强， 花青素 受到越来越多人的青睐， 关于 花青素合成途径研究及富含花青素的农作物品种培 育， 成为研究的热点之一。 [0003]种皮颜色是区分不同花生品种的重要描述性状。 花生种皮颜色性状描述分为外种 皮颜色和内种皮颜色。 目前， 花生外种皮颜色分为单色和多色两种类型， 单色类型的外种皮 颜色有白色、 褐色、 粉红色、 红色和紫色等 五种； 而多色类型的种皮颜色有红白杂色、 紫白杂 色、 褐色上有紫色条纹、 红色上有白色斑点等。 内种皮颜色分为两种类型， 分别为白色和黄 色。 而黄色又有浅黄 色和深黄色之分。 种皮对花生生品的感官评价影响较大， 深色花生种皮 对香味影响大。 花 生苦味与种皮颜色深浅 息息相关， 种皮颜色越深苦味越 浓。 [0004]在植物中， 褐变反应通常是由酚类化合物氧化而产生醌类化合物， 醌类化合物是 不稳定分子， 容易形成黄棕色聚合物。 这些反应可由漆酶(laccase)、 儿茶酚氧化酶 (catechol  oxidase)、 酪氨酸酶(tyrosinase)和过氧化物酶(peroxidases)等多酚氧化酶 催化。 漆酶广泛存在于 真核生物(高等植物、 真菌和昆虫)和原核生物中。 它们通常对还原底 物的特异性较低， 能够氧化二酚类、 单酚类抗坏血酸。 在转基因玉米中， 漆酶基因的表达与 玉米籽粒褐变和萌发受限有关。 [0005]竞争性等位基因特异 性PCR(Kompet itive Allele Specific  PCR， KASP)可在广泛 的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)， 对SNPs和特定位点上的InDels进 行精准的双等位基因判断。 与TaqMan双色标记探针法、 MassARRAY分子量阵列技术、 Affymetrix  SNP芯片相比， KASP技术灵活性更高、 试剂成本低， 同样成本至少获得两倍的数 据量。 因此， 利用花生重组自交系群体， 对花生内种皮颜色的调控基因进 行QTL定位， 并基于 目标基因开发分子标记， 可应用于花 生育种中。 发明内容 [0006]针对现有技术的不足， 本发明的目的是提供花生内种皮颜色调控基因AhLAC功能 分子标记的开发与应用。 [0007]为了实现上述目的， 本发明所采用的技 术方案是： [0008]花生内 种皮颜色调控基因AhLAC的 功能分子标记 ， 所述分子标记为 A05.114993389， 位于花生第5号染色体的114,993,389bp处， 所述分子标记位点为InD