(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211169459.5 (22)申请日 2022.09.22 (71)申请人 宁波市第一医院 地址 315499 浙江省宁波市柳汀街59号 (72)发明人 严泽军　黄又举　张栋　程跃　 (74)专利代理 机构 宁波市道同知识产权代理有 限公司 3 3478 专利代理师 郑盈 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/68(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 膀胱癌检测试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明提供了一膀胱癌检测试剂盒及其应 用， 其中所述膀胱癌标志物的检测试剂盒包括 Fe3O4@Au@DNA1与UCNPs@DNA2， 以与尿液中的膀 胱癌标志物miRNA ‑96偶联， 根据反应后的荧光判 定膀胱癌标志物的含量， 进而得以检测出膀胱的 癌变程度， 无创伤、 成本低、 检测简便、 快速、 灵敏 度高、 特异性强， 可以用于膀 胱癌的筛查， 以实现 早发现早治 疗。 权利要求书2页 说明书12页 附图3页 CN 115369174 A 2022.11.22 CN 115369174 A 1.一膀胱癌检测试剂盒， 以miRNA ‑96为标志物， 其特征在于， 包括贵金属纳米粒子@ DNA1和上转换纳米颗粒@DNA2， 其中DNA1和DNA2分别为miRNA ‑96对应的DNA序列的部分， 以 分别和miRNA ‑96偶联， miRNA ‑96的核酸序列为5 ’ ‑UUUGGCACUAGCACAU UUUUGCU‑3’。 2.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒， 其中所述 贵金属纳米粒子为金纳米粒子 。 3.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒， 其中所述贵金属纳米粒子为Fe3O4@Au磁性 纳米颗粒。 4.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒 ， 其中DNA1的核酸序列为5 ’‑ CTAGTGCCAAA‑‑C3 SH‑3’， DNA2的核酸序列为5 ’ ‑NH2 C6‑AGCAAAAATGTG‑3’。 5.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒 ， 其中DNA1的核酸序列为5 ’‑ CTAGTGCCAAAX1‑‑C3 SH‑3’， X1为1‑8个T， DNA2的核 酸序列为5 ’ ‑NH2 C6‑X2AGCAAAAATGTG ‑3’， X2为1‑8个T。 6.一膀胱癌检测试剂盒的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的制备； (2)Fe3O4@Au@DNA1的制备； (3)UCNPs@P SS的制备； 以及 (4)UCNPs@P SS@DNA2的制备。 7.根据权利要求6所述的膀胱癌检测试剂盒的制备方法， 其中在所述步骤(1)中， 包括 以下步骤： 步骤(1‑1)Fe3O4磁性纳米粒子的制备： 将 氯化铁粉末与乙二醇混合并搅拌， 加入NaAc， 搅拌， 反应完成后冷却， 用无 水乙醇和去离 子水清洗， 真空干燥得到F e3O4磁性纳米粒子； 和 步骤(1‑2)Fe3O4@Au的合成： 取上述步骤(1 ‑1)制备的Fe3O4， 加入去离子水并超声， 然后 加入氯金酸溶液并搅拌， 滴加硼氢化钠， 搅拌， 当溶液颜色由棕色变为深紫色时， 加入CTAB， 搅拌， 磁吸后用水与乙醇清洗， 最后溶于去离 子水中。 8.根据权利要求7所述的膀胱癌检测试剂盒的制备方法， 其中在所述步骤(2)中， 首先 混合TCEP与DNA1， 达到预定浓度， 然后取上述步骤(1 ‑2)中的Fe3O4@Au加入DNA1混合溶液， 分 批次加入氯化钠溶液， 超声， 磁吸分散， 测定紫外， 其中所述DNA1的核酸序列为5 ’ ‑ CTAGTGCCAAAX1‑‑C3 SH‑3’， X1为0‑8个T。 9.一膀胱癌检测试剂盒的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)金纳米颗粒的制备； (2)Au@DNA的制备； (3)UCNPs@P SS的制备； 以及 (4)UCNPs@P SS@DNA的制备。 10.根据权利要求9所述的膀胱癌检测试剂 盒的制备方法， 其中在所述步骤(1)中， 加入 HAuCl4与去离子水， 达到预定温度后注入柠檬酸钠， 冷却； 在所述步骤(2)中， 混合TCEP与 DNA1， 加入AuNPs， 反应后在磷酸盐缓冲中老化， 离心， 去除上清后重新分散于磷酸盐缓冲 中， 其中所述DNA1的核酸序列为5 ’ ‑CTAGTGCCAAAX1‑‑C3 SH‑3’， X1为0‑8个T。 11.根据权利要求6至10任一所述的膀胱癌检测试剂盒的制备方法， 其中所述步骤(3) 包括以下步骤： 步骤(3‑1)NaYF4:Yb3+,Er3+@PSS的制备， 将YCl3·6H2O、 YbCl3·6H2O、 ErCl3·6H2O的水溶液权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115369174 A 2加入到油酸与1 ‑十八烯中搅拌， 加热反应以形成油酸镧系络合物并除去水， 冷却， 滴加NH4F 和NaOH的CH3OH溶液， 搅拌， 加热除去CH3OH后， 将该溶液在N2下加热并搅拌， 冷却， 再加乙醇 沉淀， 用乙醇和环己烷洗， 真空下干燥； 和 步骤(3‑2)UCNPs分散于环己烷中， 加入DMF溶液和NOBF4， 搅拌， 加入氯仿离心后溶于DMF 溶液中， 再加入氯仿离心， 得到UCNPs@BF4， 在上述溶液中加入PSS溶液， 搅拌， 将产物离心后 重新分散 于水中， 重复数次后， 将沉淀 重新溶于DMF 溶液中。 12.根据权利要求11所述的膀胱癌的检测试剂盒的制备方法， 其中在所述步骤(4)中， 将TCT与DMF形成T CT‑DMF加合物， 加入UCNPs@PSS、 CH2Cl2， 搅拌， 然后加入DNA2， 密封下搅拌， 将获得的UCNPs@PSS@DNA用DMF与水洗， 分散于水中， 其中所述DNA2的核酸序列为5 ’ ‑NH2 C6‑ X2AGCAAAAATG TG‑3’， X2为0‑8个T。 13.根据权利要求6至10任一所述的膀胱癌的检测试剂盒的制备方法， 其中所述步骤 (3)包括NaYF4:Yb3+,Tm3+@PSS的制备： 将YCl3·6H2O、 YbCl3·6H2O、 TmCl3·6H2O的水溶液与油酸 和1‑十八烯混合， 搅拌， 反应以形成油酸镧系络合物并除去水， 冷却， 滴加NH4F和NaOH的 CH3OH溶液， 搅拌， 除去CH3OH后， 将该溶液在N2气氛下加热并搅拌， 冷却， 加乙醇沉淀， 用乙醇 和环己烷洗， 真空干燥。 14.根据权利要求13所述的膀胱癌的检测试剂盒的制备方法， 其中在所述步骤(4)中， 将TCT与DMF形成TCT ‑DMF加合物， 将UCNPs@PSS、 CH2Cl2加入到TCT ‑DMF加合物中， 搅拌， 然后 加入DNA2， 密封下搅拌， 将获得的UCNPs@PSS@DNA用DMF与 水洗， 分散于水中， 其中所述DNA2 的核酸序列为5 ’ ‑NH2 C6‑X2AGCAAAAATGTG‑3’， X2为0‑8个T。 15.一膀胱癌的检测方法， 其特征在于， 使用膀胱癌检测试剂盒检测尿液， 其中膀胱癌 检测试剂盒中的Fe3O4@Au@DNA1或Au ‑DNA1、 UCNPs@PSS@DNA2与 尿液中的膀胱癌miRNA ‑96反 应， 通过测定荧 光强度来判定miRNA ‑96的含量， 进 而用于膀胱癌的诊断。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115369174 A 3