(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210568828.1 (22)申请日 2022.05.24 (71)申请人 珠海市现代农业发展中心 （珠海市 金湾区台湾农民创业园管理委员 会、 珠海市农渔业科研与推广中心） 地址 519075 广东省珠海市香洲区永南路 33号隆盛大厦四楼 (72)发明人 李勇　毛灿　于方兆　古群红　 苏惠冰　李望东　盘润洪　郭建谊　 文彦东　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 朱继超 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 脱鳞病毒检测体系 、 引物、 探 针及方法 (57)摘要 本发明提供了脱鳞病毒检测体系、 引物、 探 针及方法。 所述引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1和SEQ  ID NO.2所示， 所述探针的核苷酸序 列如SEQ ID NO.3所示。 所述脱鳞病毒检测体系 包括所述引物和/或探针。 所述脱鳞病毒检测方 法采用微滴式数字PCR检测方法， 即采集待测鱼 类的组织样本后， 提取样本的DNA， 然后以DNA为 模板采用微滴式数字PCR， 可准确检测出待测鱼 类是否感染或携带SDDV， 本发明的微滴式数字 PCR检测方法灵敏度高， 在养殖鱼类优质亲本选 择中具有较好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114891926 A 2022.08.12 CN 114891926 A 1.引物， 其特征在于， 包括用于特异性扩增脱鳞病毒的上游引物57 ‑F和下游引物57 ‑R， 所述上游引物57 ‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述下游引物57 ‑R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示。 2.探针， 其特征在于， 包括用于特异性检测脱鳞病毒的探针57 ‑P， 所述探针57 ‑P的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 3.脱鳞病毒检测体系， 其特征在于， 包括ddPCR探针法预混液， 所述ddPCR探针法预混液 包括如权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针。 4.根据权利要求3所述脱鳞病毒检测体系， 其特征在于， 所述ddPCR探针法预混液还包 括DNA聚合酶和/或无RNA酶蒸馏水。 5.根据权利要求4所述脱鳞病毒检测体系， 其特征在于， 所述ddPCR探针法预混液还包 括DNA聚合酶和无RNA酶蒸馏水， 所述 ddPCR探针法预混液的总体积为29 μL， 包括： 15 μL  2倍 浓度的Probe  dPCR SuperMix、 2.4 μL浓度为10 μM的上游引物5 7‑F、 2.4 μL浓度为10 μM的下游 引物57‑R、 0.75 μL浓度为10 μM的探针57 ‑P、 8.45 μL无RNA酶蒸馏水。 6.根据权利要求3所述脱鳞病毒检测体系， 其特征在于， 还包括探针法ddPCR微滴生成 油、 ddPCR微滴检测油、 阴性对照、 阳性对照或无RNA酶蒸馏水中的至少一种。 7.根据权利要求6所述脱鳞病 毒检测体系， 其特征在于， 所述脱鳞病 毒检测体系 包括阳 性对照， 所述阳性对照为含有 脱鳞病毒基因序列的质粒。 8.权利要求1所述引物、 权利要求2所述探针或权利要求3至7任一项所述脱鳞病毒检测 体系在非诊疗为目的检测脱鳞病毒中的应用。 9.脱鳞病毒的检测方法， 其特 征在于， 包括 步骤： 制备PCR反应模板： 提取待测样品的DNA， 作为PCR反应模板； 配制ddPCR反应液： d dPCR探针法预混液2 9 μL， PCR反应模板1 μL； 制备微滴： 将8联排管放入微滴制备仪相对应位置， 将微液滴生成芯片放入配套的生成 芯片卡具中， 压下卡具固定芯片， 在水孔中加入ddPCR反应液30 μL， 在油孔中加入180 μL微液 滴生成油， 然后将芯片的水孔和油孔盖上微液滴生成芯片密封垫， 将装有微液滴生成芯片 的卡具放入仪器， 压下把手固定， 操作仪器运行， 生成微液滴； 扩增： 取出卡具， 将含有微液滴的8联排管盖上密封 盖， 转入PCR仪中进行扩增； 检测： 将完成PCR扩增的微液滴8联管和微液滴检测芯片分别放入检测芯片机械卡具相 对应位置， 压下卡具上盖固定芯片， 在油孔1和油孔2中分别加入430 μL和500 μL微液滴检测 油， 盖上微滴检测芯片密封垫， 然后将卡具放入生物芯片分析仪中， 使用微滴分析仪检测微 滴进行读数， 分析每管反应 体系中发出荧 光的微滴数， 显示样品中脱鳞病毒检测结果。 10.根据权利要求9所述检测方法， 其特征在于， 所述扩增步骤中， 所述扩增的程序为95 ℃预变性10分钟； 94℃变性30秒， 63℃退火60秒， 共40个循环； 4℃恒温， 结束反应， 每步都设 置1.5℃/秒的变温速度。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891926 A 2脱鳞病毒检测体系 、 引物、 探针及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及水生动 物病毒检测技术领域， 特别涉及脱鳞病毒检测体系、 引物、 探针 及方法。 背景技术 [0002]脱鳞病毒(Scale  drop disease Virus,SDDV)是一种新生鱼虹彩病毒。 早在2002 年， 马来西亚养殖金目鲈出现脱鳞症(Scale  drop syndrome,SDS)病害。 2012年， 新加坡研 究人员首次自SDS金 目鲈观察虹彩病毒样病毒颗粒， 但抗RSIV的单克隆抗体不能识别 该病 毒， 提出该病毒可能是一种有别 于RSIV的新型鱼虹彩病毒。 2015年， MSD  Animal Health的 研究人员自新加坡的SDS金目鲈通过细胞培养途径培养出该病毒， 命名为脱鳞病病毒 (SDDV)。 [0003]黄鳍鲷具有极高的养殖价值， 但近年来黄鳍鲷 主养区在夏季高温季频繁出现黄鳍 鲷腹水症状， 发病鱼规格10～140g不等， 临床症状主要表现为腹部肿胀， 有时也伴有眼球脱 落， 解剖可 见大量黄色腹水。 当地养殖户将该病称为 “黄鳍鲷腹水病 ”。 [0004]国内多个研究团队对该病害进行了跟踪研究， 但一直没有可信结论。 2020年6月 初， 珠海市现代农业发展中心与中山大学团队合作， 最终通过细胞培养方法分离到SDDV样 病毒。 对该病毒系统的全基因组、 全蛋白质组、 细胞感染病理、 透射电镜观察、 回归感染、 临 床病例、 组织病理及与ISKNV的抗原交叉反应研究， 大量充分的研究证据显示SDDV是黄鳍鲷 腹水病的病毒性病原。 [0005]目前对SDDV病毒的检测技术较少， 基本存在于对国外地区的套式PCR和荧光定量 PCR。 但这些检测方法的灵敏度有限， 在拷贝数较少的情况下很难被检测 到， 较容易出现假 阴性。 因此， 有必要开发一种灵敏度高的S DDV检测方法。 发明内容 [0006]本发明目的在于提供脱鳞病毒检测体系、 引物、 探针及方法， 以解决现有技术中所 存在的一个或多个技 术问题， 提供至少一种有益的选择或创造条件。 [0007]本发明的第一方面在于提供一对引物的核苷酸序列。 所述引物为用于特异性扩增 脱鳞病毒的上游引物57 ‑F和下游引物57 ‑R， [0008]上游引物57 ‑F： 5’ ‑GCACTAATGATAATGCAATTTCTGTAC‑3’(SEQ ID NO.1)； [0009]下游引物57 ‑R： 5’ ‑TCACGCTCT TCGTTGGTCAG‑3’(SEQ ID NO.2)。 [0010]本发明的第二方面在于提供一段探针的核苷酸序列。 所述探针为用于特异性检测 脱鳞病毒的探针57 ‑P， [0011]探针57‑P： 5’ ‑CACCCGCTCTGACTGAAGTTAGTGTTATG ‑3’(SEQ ID NO.3)。 探针的5 ’端 带有荧光报告基团， 如FAM、 VIC、 HEX、 ROX、 JOE、 Cy3、 Cy5等； 3 ’端带有荧光猝灭基团， 如 TAMRA、 BHQ ‑1、 BHQ‑2、 BHQ‑3等。 [0012]所述引物及所述探针均以S DDV的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列为靶标。说　明　书 1/6 页 3 CN 114891926 A 3