(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210678354.6 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 苏州鱼之源生物科技有限公司 地址 215141 江苏省苏州市相城区阳澄湖 消泾村 (72)发明人 杜佳　刘青华　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 王艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)G16B 30/10(2019.01) (54)发明名称 美洲鲥鱼肌肉组织中提取DNA的方法、 五种 性别相关的分子标记和应用 (57)摘要 本发明公开了美洲鲥鱼肌肉组织中提取DNA 的方法、 五种性别相关的分子标记和应用， 本发 明通过采用了特定的预处理方法对美洲鲥鱼的 肌肉组织进行了固定和冷冻， 然后再进行肌肉组 织的DNA提取， 获得了高质量的DNA模板， 然后进 一步以该方法提取的DNA模板筛选获得了能够区 分美洲鲥鱼性别的五种分子标记分子， 而且基于 以上的五种分子标记进一步获得了能够扩增五 对分子标记的特异性引物， 本发 明获得的五对特 异性引物能够准确区分遗传性性别， 本发明还提 供了鉴别美洲鲥鱼性别的分子标记方法， 本发明 通过采用从肌肉组织提取DNA的方法， 可以更准 确的筛选 出性别特异性分子标记， 保证本发明中 引物对性别鉴定的准确度为10 0%。 权利要求书1页 说明书9页 序列表4页 附图6页 CN 114958999 A 2022.08.30 CN 114958999 A 1.一种美洲鲥鱼肌肉组织DNA提取方法， 其特征在于， 所述肌肉组织DNA提取方法包括 对肌肉组织进 行预处理， 所述预 处理包括将 50%酒精或20%甲醛对美洲鲥鱼的肌肉组织进 行 固定处理然后放入 ‑20℃或‑80℃冷冻处 理。 2.一种美洲鲥鱼性别相关的分子标记的获得方法， 其特征在于， 所述方法采用权利要 求1所述的提取方法分别提取雄性美洲鲥鱼和雌性美洲鲥鱼的肌肉组织DNA， 然后通过简化 基因组方法测序获得美洲鲥鱼性别相关 分子标记。 3.一种美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段的获得方法， 其特征在于， 所述获得 方法包括将权利要求2的方法获得的分子标记与NCBI数据库中的雄鲥鱼组装基因组序列进 行比对， 获得美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段的碱基序列。 4.按照权利要求2的方法获得的美洲鲥鱼性别相关的分子标记， 所述美洲鲥鱼性别相 关的分子标记的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1或SEQ  ID NO： 2或SEQ  ID NO： 3或 SEQ ID NO： 4 或SEQ ID NO： 5所示。 5.按照权利要求3的方法获得的美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段， 其特征在 于， 所述基因片段的碱基序列如SEQ  ID NO： 6或7或8或9或10所示。 6.用于检测权利要求4所的美洲鲥鱼性别相关的分子标记或权利要求5所述的基因片 段的特异性引物对， 其特征在于， 所述特异性引物对序列分别如SEQ  ID NO： 11和SEQ  ID  NO： 12； SEQ  ID NO： 13和SEQ  ID NO： 14； SEQ  ID NO： 15和SEQ  ID NO： 16； SEQ  ID NO： 17和SEQ   ID NO： 18； SEQ  ID NO： 19和SEQ  ID NO： 20所示。 7.权利要求6所述的特异性引物对在制备鉴定美洲鲥鱼的遗传性别的试剂盒中的应 用。 8.一种鉴定美洲鲥鱼的遗传性别的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求6所 述的特异性引物对。 9.一种鉴别美洲鲥鱼性别的DNA标记方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： （1） 提取 未知性别的美洲鲥鱼的肌肉组织中的DNA； （2） 采用权利要求6所述的特异性引物对或权利要求8所述的试剂盒进行PCR扩增； （3） 当PCR扩增产物显示350bp、 463bp、 430bp、 170bp或185bp条带时， 即可判断为雄性美 洲鲥鱼； 当PCR扩增产物未 发现有350bp、 463bp、 430bp、 170bp或185bp条带时， 即可判断为雌 性美洲鲥鱼。 10.根据权利要求9所述的鉴别美洲鲥鱼性别的DNA标记方法， 其特征在于， 所述PCR扩 增体系包括： 2   × Taq Plus Master Mix I Dye Plus、 权利要求6所述的特异性引物对、 DNA、 水； PCR反应 条件如下： 9 5℃预变性3min， 95℃变性15s， 60℃退火30s， 72℃延伸1min， 72 ℃终延伸5mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958999 A 2美洲鲥鱼肌肉组织中提取DNA的方 法、 五种性别相关的分子标 记和应用 技术领域 [0001]本发明属于鱼类遗传学领域， 具体涉及美洲鲥鱼肌肉组织中提取DNA的方法、 五种 性别相关的分子标记和应用。 背景技术 [0002]世界上最名贵的鲥鱼品种包括美洲鲥鱼、 中华鲥鱼和印度鲥鱼， 鲥鱼养殖和繁殖 一直是困扰国内外 鱼类生物学家和养殖技术人员的难题， 其养殖和繁殖的成功案例在国内 外鲜有报道。 因为鲥鱼具有与普通养殖鱼类完全不同的生理特性， 它对外界环境变化极为 敏感， 身体娇嫩、 娇气急躁、 应激反应强， 极易受伤致死。 上个世纪末， 我国学者对中华鲥鱼 养殖和人工繁殖进行了初步研究， 但结果不尽人意。 中华鲥的资源 日益衰竭， 已难见踪迹。 在中华鲥濒临灭绝情况下， 本团队自2003年， 在鲥鱼生物学、 行为特性和养殖技术等方面空 白的情况下， 进行美洲鲥鱼的引进、 驯养、 人工繁殖和育苗以及种质改良等方面的研发。 近 20年来， 本团队以 “十年磨一剑 ”、“摸着石头过河 ”的精神， 在美洲鲥鱼养殖生物学、 繁殖和 育苗、 和种质改良等方面取得了多项成果， 引领鲥鱼养殖产业发展。 在养殖成功的基础上， 开展鲥鱼繁殖方面的尝试并产业化， 彻底摆脱了鲥鱼养殖产业长期依赖进口受精卵的局 面。 [0003]在美洲鲥鱼品系选育、 全基因组学测序和简化基因组测序技术的基础上， 本团队 分离出5个美洲鲥鱼的雄性分子标记， 鉴别xx假雄鱼(neomales)， 成功应用于全雌鲥鱼的生 产。 全雌养殖发挥了雌鱼生长快的优势， 生产价格昂贵的大规格鲥鱼， 更重要的是， 可有效 避免雄鱼在春季追尾造成的大量死亡和 体重降低的损失， 从而提高养殖效率28％以上， 成 为促进鲥鱼养殖业发展的重要措施。 本技术从鲥鱼养殖产业链的源头和养殖模式的更新提 供关键技术的支撑， 可持续地提高鲥鱼养殖产业的效率， 对世界其他鲥鱼品种的养殖产业 开发有着重要的意 义。 [0004]而其他鱼体 的的特异性分子标记技术多采用鱼尾鳍和鳞片进行DNA提取， 但是实 际上鱼尾鳍和鳞片坚硬， 研磨不彻底容易造成DNA提取浓度偏低， 引起引物扩展序列不准 确。 而且尾鳍或鳞片中的纤维结构、 骨质层、 取样重量、 样品新鲜程度及保存方式均影响提 取DNA质量。 [0005]因此亟需一种能够提取美洲鲥鱼中高质量DNA的方法， 并进而获得更多的性别鉴 定的分子标记。 发明内容 [0006]发明目的： 本发明所要解决的技术问题是提供了一种美洲鲥鱼肌肉组织DNA提取 方法， 该方法通过对肌肉组织进行固定化和冷冻的方式进行预处理， 进而获得完整而且高 质量的DNA模板。 本发明中模板DNA的质量直接影响鉴定结果， 用高质量DNA可避免PCR反应 中出现假阴性， 同时提高实验的敏感性和特异性。 最后通过采用不同浓度的引物及DNA验说　明　书 1/9 页 3 CN 114958999 A 3