(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210756221.6 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50号 (72)发明人 谭永安　张杰钰　肖留斌　赵静　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 王艳 (51)Int.Cl. C12N 9/22(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01)C12N 15/866(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 绿盲蝽RNA降解酶、 其编码基因、 载体、 菌株 及其应用 (57)摘要 本发明公开了绿盲蝽RNA降解酶， 所述绿盲 蝽RNA降解酶的氨 基酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 本发明还公开了编码所述的绿盲 蝽RNA降解酶的 核酸或基因， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 本发明还公开了表达盒、 重组载体、 重组细胞或 重组菌株及其应用。 本发明首次获得了绿盲蝽 RNA降解酶的氨基酸及其基因序列， 并构建其 pFastBac1表 达载体， 并在大肠杆菌DH10Bac中转 化鉴定获得重组杆状质粒转染SF9细胞获得P1~ P3代病毒， 纯化蛋白浓度为0.6mg/ml。 纯化出的 RNA降解酶蛋白可为此重组 蛋白体外降解的功能 验证提供前期准备， 为后续探究其重组 蛋白降解 dsRNA的能力提供一定的实验支撑 。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图3页 CN 115161306 A 2022.10.11 CN 115161306 A 1.绿盲蝽RNA降解酶， 其特征在于， 所述绿盲蝽RNA降解酶的氨基酸序列如SEQ  ID NO.4 所示。 2.编码权利要求1所述的绿盲蝽RNA降解酶的核酸或基因， 其核苷酸序列如SEQ  ID  NO.3所示。 3.扩增权利要求2所述的绿盲蝽RNA降解酶的核酸或基因 的引物对， 所述引物对序列如 SEQ ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示。 4.表达盒、 重组载体、 重组细胞或重组菌株， 其特征在于， 其包含权利要求2所述的核酸 或基因。 5.根据权利要求4所述的重组载体， 其特征在于， 所述重组载体为pFastbacI ‑ AldsRNase。 6.根据权利要求 4所述的重组菌株， 其特 征在于， 所述重组菌株为重组大肠杆菌 。 7.权利要求2所述的核酸或基因、 权利要求4所述的表达盒、 重组载体、 重组细胞或重组 菌株在制备绿盲蝽RNA降解酶蛋白中的应用。 8.绿盲蝽RNA降解酶蛋白的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1） 绿盲蝽RNA降解酶蛋白基因的获得： 根据已知近缘物种基因序列设计PCR扩增引物， 扩增权利要求2所述的绿盲蝽RNA降解酶的基因； 2） 绿盲蝽RNA降解酶蛋白重组杆状病毒表达载体的构建和鉴定； 3） 绿盲蝽RNA降解酶蛋白重组杆状病毒的转染和收获； 4） 绿盲蝽RNA降解酶蛋白的纯化。 9.根据权利要求8所述的绿盲蝽RNA降解酶蛋白的制备方法， 其特征在于， 步骤2） 中所 述绿盲蝽RNA降解酶蛋白重组杆状质粒的构建和鉴定步骤是将绿盲蝽RNA降解酶基因导入 质粒pFastBac1 中， 并在大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中诱导转化、 筛选蓝白斑， 得到重组杆 状病毒表达载体。 10.根据权利要求8所述的绿盲蝽RNA降解酶蛋白的制备方法， 其特征在于， 步骤3） 中的 绿盲蝽RNA降解酶蛋白重组杆状病毒的转染步骤为将重组杆状病毒表达载体先用SF9转染 培养P1代病毒， 再扩增和收获P2和P3代病毒， 步骤4） 中的蛋白的纯化步骤为将步骤3） 中得 到的病毒利用N i柱亲和层析加以纯化。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115161306 A 2绿盲蝽RNA降解酶、 其编码基因、 载体、 菌株及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及农业科学及生物学技术领域， 具体涉及绿盲蝽RNA降解酶、 其编码序 列、 载体、 菌株及其重组蛋白和应用。 背景技术 [0002]绿盲蝽Apolygus  lucorum(Hemiptera： Miridae)属半翅目盲蝽科， 分布范围广泛， 为蔬菜、 果树等多种经济作物上的重要害虫。 RNA干扰(RNAinterference， RNAi)是由外源双 链RNA(double ‑strand RNA， dsRNA)引发内源互补信使RNA(messenger  RNA， mRNA)沉默的过 程。 dsRNA介导的RNA干扰在半翅目、 双翅目、 鳞翅目等昆虫中应用成功， 但是不同昆虫的 RNAi效率差异很大， 其中最重要的因素是昆虫体内存在一类RNA降解酶(dsRNase)， 通过降 解双链RNA从而降低RNAi的效率。 [0003]因此， 研究绿盲蝽AldsRNase基因编码结构和其体外重组蛋白及重组蛋白纯化后 降解的功能验证， 探究其重组蛋白Al dsRNase降解 dsRNA的能力， 可为提高RNAi效率提供一 定的技术支撑。 发明内容 [0004]发明目的： 本发明所要解决的技术问题是提供了一种绿盲蝽RNA降解酶蛋白的制 备方法。 [0005]技术方案： 为了解决上述技术问题， 本发明提供了绿盲蝽RNA降解酶， 所述绿盲蝽 RNA降解酶的氨基酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 [0006]本发明的内容还包括编码述的绿盲蝽RNA降解酶的核酸或基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示。 [0007]本发明的内容还包括扩增所述的绿盲蝽RNA降解酶的核酸或基因的引物对， 所述 引物对序列如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示。 [0008]本发明的内容还包括表达盒、 重组载体、 重组细胞或重组菌株， 其包含所述的核酸 或基因。 [0009]其中， 所述重组载体为pFastbacI ‑AldsRNase， 其他能够用于该基因表达的载体也 同样适用。 [0010]其中， 所述重组菌株包括但不仅限于 重组大肠杆菌 。 [0011]本发明的内容还包括所述的核酸或基因、 所述的表达盒、 重组载体、 重组细胞或重 组菌株在制备绿盲蝽RNA降解酶蛋白中的应用。 [0012]本发明的内容还 包括绿盲蝽RNA降解酶蛋白的制备 方法， 包括以下步骤： [0013]1)绿盲蝽RNA降解酶蛋白基因的获得： 根据已知 近缘物种基因序列设计PC R扩增引 物， 扩增所述的绿盲蝽RNA降解酶的基因； [0014]2)绿盲蝽RNA降解酶蛋白重组杆状病毒表达载体的构建和鉴定； [0015]3)绿盲蝽RNA降解酶蛋白重组杆状病毒的转染和收获；说　明　书 1/5 页 3 CN 115161306 A 3