(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210982528.8 (22)申请日 2022.08.16 (71)申请人 李世朋 地址 454000 河南省焦作市山阳区焦东北 路博大世纪华庭小区2号楼 9层49号 (72)发明人 李世朋　王朏朏　乔兵兵　张海明　 (74)专利代理 机构 上海尚象专利代理有限公司 31335 专利代理师 张园园 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6809(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 筛选血清外泌体LncRNA HU LC作为肝癌早期 标记物的方法及其制备 试剂盒的用途 (57)摘要 本发明公开了一种筛选血清外泌体LncRNA   HULC作为肝癌早期标记物的方法及其制备试剂 盒的用途。 该筛选方法是通过定量RT ‑PCR从基因 水平的联合检测血清 外泌体LncRNA  HULC在早期 肝癌患者血清中的变化， 实现肝癌的早期标记物 的优选和确定。 该血清外泌体LncRNA  HULC为肝 癌早期标记物可以用于制备试剂盒。 该试剂盒是 包含HULC引物对的PCR试剂盒。 本发明通过研究 血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期 诊断标记 物的价值， 研发了肝癌早期诊断试剂盒， 其作为 体外诊断试剂， 使用简便、 快速、 敏感性与特异性 强， 能够用于实现肝癌的早期诊断， 提高肝癌患 者的生存率， 并且易于 推广应用。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115261476 A 2022.11.01 CN 115261476 A 1.一种筛选出血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期标记物的方法， 其特征在于， 该方 法包含： 步骤1， 分离正常人及肝癌患 者血清外泌体， 并分别检测正常人血清和早期肝癌患者血 清外泌体L ncRNA的表达； 步骤2， 对正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体LncRNA中差异表达的基因进行聚类 分析， 找到在肝癌患者血清外泌体LnCRNA 中差异表达明显的基因， 作为新的肝癌标志物的 候选LncRNA； 步骤3， 对肝癌标志物的候选LncRNA在基因水平上进行鉴定， 找到若干特异性和敏感性 强的诊断基因， 包括HULC； 步骤4， 对正常人群和肝癌患者血清进行检测， 观察外泌体LnCRNA作 为肝癌早期标记物 的敏感性和特异性； 步骤5， 确定血清外泌体L ncRNA HULC为肝癌早期标记 物。 2.如权利 要求1所述的筛选出血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期标记物的方法， 其 特征在于， 所述的步骤1中， 利用超高速 离心分离正常人及肝癌 患者血清外泌体。 3.如权利 要求1所述的筛选出血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期标记物的方法， 其 特征在于， 所述的步骤3中， 利用荧光实时定量qRT ‑PCR和原位杂交， 对肝癌标志物的候选 LncRNA在基因水平上进行鉴定 。 4.如权利 要求1所述的筛选出血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期标记物的方法， 其 特征在于， 所述的步骤4中， 利用荧光 实时定量qRT ‑PCR， 对正常人群和肝癌患者血清进行检 测。 5.一种如权利 要求1所述的血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期标记物的用途， 其特 征在于， 所述的标记 物用于制备 试剂盒。 6.一种利用如权利要求1所述的血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期标记物制备的 试剂盒， 其特 征在于， 所述的试剂盒是包 含HULC引物对的PCR试剂盒。 7.如权利要求6所述的利用血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂 盒， 其特征在于， 所述的HULC引物对包括上游引物和下游引物； 上游引物序列为： 5 ’ ‑ GGGGTGGAACTCATGATG GAATTGG‑3’； 下游引物序列为： 5 ’ ‑GCCAGGAAACTTCTTGCTTGATGC‑3’。 8.如权利要求6所述的利用血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期标记物制备的试剂 盒， 其特征在于， 所述的试剂盒， 在进行荧光实时定量PCR反应扩增时， PCR反应体系为： 50 ℃， 2min； 95℃， 15s， 6 0℃， 1min； 35个循环； 95℃， 10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261476 A 2筛选血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期标记物的方 法及 其制备试剂盒的用途 技术领域 [0001]本发明涉及一种生物医学领域的用于肝癌早期诊断的标记物及其制备试剂盒的 方法与用途， 具体地， 涉及一种筛选血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌早期标记物的方法及 其制备试剂盒的用途。 背景技术 [0002]肝癌的恶性程度极高， 被称为 “癌中之王 ”。 肝癌的早期症状很不典型， 往往很容易 被忽视， 等出现明显的症状已是中晚期 。 目前临床肝癌诊疗中存在着早期诊断难、 治疗缺乏 针对性等问题。 因此， 对早期肝癌及肝癌标记物的研究和确定， 特别是利用其制备灵敏有效 的试剂盒， 就尤为重要和迫切。 [0003]目前， 国内外临床上常用的肝癌诊断标记物为甲胎蛋白(AFP)， 但AFP诊断肝癌的 敏感度和特异度并不十 分理想。 γ ‑谷氨酰转肽酶同工酶 Ⅱ(GGTⅡ)在肝癌患者血清中明显 升高， 而在健康人体内几乎检测不到， 曾被认为是HCC(肝细胞癌， hepatocellular   carcinoma)的特异性标志物， 但用于诊断HCC的敏感性仅为43.8％， 后续研究证实GGT Ⅱ在 不同肝脏疾病中均有表达， 特异性不强， 限制了其临床应用。 超声检查通常难以发现、 确认 小于3cm的肿块， 且超声医师个体诊断水平的差异对诊断结果有很大影响。 CT诊断费用较 高， 产生的辐射对患者具有一定影响， 难以作为定期筛查方式推广应用。 而MRI的诊断费用 更高， 目前也没有成为常规定期筛查方式。 [0004]因此， 寻找诊断肝癌特别是早期肝癌的分子标记物， 成为目前研究的重点和难点。 早期诊断对肝癌患者的治疗、 预后意义重大。 在肝癌进展的不同阶段， 肿瘤标志物的种类、 数量和含量均发生变化， 随着相关研究的深入， 新的肝癌标志物不断被发现， 而寻找灵敏、 准确的肝癌标志物， 制备使用方便的试剂盒， 对于早期肝癌进行定性定量检测是十分必要 的。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种用于肝癌早期诊断的标记物及其制备试剂盒的方法与 用途， 可以解决现有技术中存在的问题， 得到简便、 快速、 敏感性与特异性强的标记物和试 剂盒， 能够用于肝癌早期诊断， 提高肝癌 患者的生存率， 并且易于推广应用。 [0006]为了达到上述目的， 本发明提供了一种筛选出血清外泌体LncRNA  HULC作为肝癌 早期标记物的方法， 其中， 该方法包含： 步骤1， 分离正常人及肝癌患者血清外泌体， 并分别 检测正常人血清和早期肝癌患者血清外泌体LncRNA的表达； 步骤2， 对正常人血清和早期肝 癌患者血清外泌体LncRNA中差异表达的基因进行聚类分析， 找到在肝癌患者血清外泌体 LnCRNA中差异表达非常明显的基因， 作为新的肝癌标志物的候选LncRNA； 步骤3， 对肝癌标 志物的候选LncRNA在基因水平上进行鉴定， 找到若干特异性和敏感性强的诊断基因， 包括 HULC； 步骤4， 对正常人群和肝癌患者血清进行检测， 观察外泌体LnCRNA作为肝癌早期标记说　明　书 1/5 页 3 CN 115261476 A 3