(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210692847.5 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 重庆大学 地址 400030 重庆市沙坪坝区沙北街83号 (72)发明人 罗阳　陈艺　陈晓辉　陈恒屹　 (74)专利代理 机构 石家庄科诚专利事务所(普 通合伙) 13113 专利代理师 谷婷婷　左燕生 (51)Int.Cl. C12Q 1/6876(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12Q 1/6818(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 端粒酶表达丰度和活性综合检测技术的探 针组合及其应用 (57)摘要 本发明属于酶检测技术领域， 公开了一种端 粒酶表达丰度和活性综合检测技术的探针组合 及其应用， 该探针组合包括可形成发夹结构的启 动探针、 可与启动探针互补形成双 链复合结构的 端粒酶引物探针、 可形成发夹结构的杂交链式反 应探针和包括连接区、 DNAzyme活性区和识别区 的MNAzyme探针。 探针组合用于端粒酶表达丰度 和活性综合检测技术， 通过探针预处理形成发夹 结构探针和双链杂交茎环结构探针， 进一步将探 针负载于二氧化锰纳米材料， 形成DNA ‑MnO2复合 物， 利用荧光共聚焦成像， 实现端粒酶的痕量检 测， 同步实现端粒酶表达丰度定量和端粒酶活性 量化。 本发明可用于高灵敏度、 高特异性对细胞 内端粒酶原位检测。 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图6页 CN 115044662 A 2022.09.13 CN 115044662 A 1.一种端粒酶表达丰度和活性综合检测技术的探针组合， 其特征在于， 该探针组合包 括可形成发夹结构的启动探针、 可与启动探针互补形成双链复合结构的端粒酶引物探针、 可形成发夹结构的杂交链式反应探针和包括连接区、 DNAz yme活性区和识别区的MNAz yme探 针； 其中， 启动探针修饰有荧光基团和淬灭基团， 且启动探针形成发夹结构后游离的单链 端设计有与端粒酶引物探针互补的序列， 所述与端粒酶引物探针互补的序列的碱基数为13～18； 杂交链式反应探针修饰有FRET荧光基团对， 由杂交链式反应探针H1和杂交链式反应探 针H2组成； 所述杂交链式反应探针具有 结合端粒酶延伸产 物形成杂交链式反应的立 足点序 列； MNAzyme探针由MNAzyme探针DC1和MNAzyme探针DC2组成， MNAzyme探针DC1的识别区与 端粒酶延伸产物互补； MNAzyme探针DC2还具有与其识别区序列互补的端粒酶引物区； 单链状态的启动探针具有与MNAzyme探针识别区互补形成MNAzyme 结构的序列。 2.根据权利要求1所述的端粒酶表达丰度和活性综合检测技术的探针组合， 其特征在 于， 所述与端粒酶引物探针互补的序列的碱基数为15～18。 3.根据权利要求1或2所述的端粒酶表达丰度和活性综合检测技术的探针组合， 其特征 在于， 探针的序列分别为： ①端粒酶引物探针TS： 5’ ‑AATCCGTCGAGCAGAGT T‑3’； ②启动探针H 0： 5’ ‑FAM‑AGGGTTAGGGAGCCTCAGCTCGAGTC CCTAACCC/iDabcyldT/A ACTCTGCTCGACG GA‑3’； ③杂交链式反应探针H1： 5’ ‑Cy3‑TAGGGTTAGGGCACGCAC CCTAACCC/iBHQ1dT/A ACCC‑3’； ④杂交链式反应探针H2： 5’ ‑TGCGTGCCCTAACCC/iCy5dT/AG GGTTAGGGTTAGGG‑3’； ⑤MNAzyme探针DC1： 5’ ‑ACCCTAACCTCCGAGCCTCCCTAACCCT‑3’； ⑥MNAzyme探针DC2： 5’ ‑CTCGAGCTGAG GCGGTCGAAAACTCTGCTCGACG GATTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGT TrA‑3’。 4.权利要求1～3中任意一项所述的探针组合在端粒酶表达丰度和活性综合检测技术 中的应用。 5.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于， 所述探针组合负载于含锰生物纳米材 料。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述含锰生物纳米材料为二氧化锰纳米材 料或含锰 元素有机框架纳米材 料。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特 征在于， 包括依次进行的以下步骤： S1.探针预处 理 分别对启动探针、 杂交链式反应探针和MNAzyme探针进行退火处理， 得发夹结构启动探 针、 发夹结构杂交链式反应探针和发夹结构MNAzyme探针； 取端粒酶引物探针和发夹结构启动探针， 孵 育， 得双链杂交茎环结构探针；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115044662 A 2S2.负载探针及检测 取二氧化锰纳米材料水溶液、 发夹结构杂交链式反应探针、 发夹结构MNAzyme探针和双 链杂交茎环结构探针混匀， 静置 至二氧化锰纳米材 料负载饱和， 得DNA ‑MnO2复合物； 取待测细胞， 加入培养基体积0.05～0.15倍的DNA ‑MnO2复合物， 孵育后对细胞进行共聚 焦成像， 记录荧 光结果； S3.荧光结果判定 荧光结果中启动探针的荧 光基团的荧 光信号与端粒酶表达 丰度呈正相关； 荧光结果中FRET荧光基团对中的受体荧光基团的荧光信号与端粒酶的酶活性呈正相 关。 8.根据权利要求7 所述的应用， 其特 征在于， S1中， 所述孵 育的温度为25～38℃。 9.根据权利要求7或8所述的应用， 其特征在于， S2中， 所述孵育为于细胞培养条件下孵 育1～6h； 所述共聚焦成像前对细胞进行固定、 洗涤。 10.根据权利要求7或8所述的应用， 其特征在于， 所述二氧化锰纳米材料水溶液的终浓 度为25～5 5 μg/mL； 所述发夹结构杂交链式反应探针、 发夹结构MNAzyme探针和双链杂交茎环结构探针的 物质的量终浓度相同， 均为80～10 0nmol/L。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115044662 A 3