(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210661981.9 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510000 广东省广州市天河区五山 申请人 华农 （肇庆） 生物产业 技术研究院有 限公司 (72)发明人 陈瑞爱　杨泽坤　向程威　黄梅　 王婷　杨洁　徐婷　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 王建宇 (51)Int.Cl. C12N 15/867(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/66(2006.01)C12N 15/40(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/58(2006.01) C12R 1/91(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系的 构建方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种稳定表达鸭坦布苏病毒 NS1蛋白的细胞系的构建方法及其应用， 涉及分 子生物学技术领域。 该构建方法包括： (1)采用构 建重组质粒； (2)采用所述重组质粒转染细胞， 得 到重组细胞； (3)将重组细胞和慢病毒包装质粒 共同培养， 得到慢病毒样颗粒的培养 液； (4)将慢 病毒样颗粒的培养液感染宿主细胞， 筛选得到稳 定株， 培养后获得细胞系。 实施本发明， 可稳定提 升NS1mRNA和蛋白的表达水平。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图4页 CN 115074389 A 2022.09.20 CN 115074389 A 1.一种用于钓取鸭坦布苏病 毒中NS1基因的引物组合， 其特征在于， 包括引物一和引物 二， 所述引物一为核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示的DNA分子； 所述引物二为核苷酸序列如 SEQ ID NO： 2所示的DNA分子 。 2.一种稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系的构建方法， 其特 征在于， 包括： (1)采用如权利要求1所述的引物组合构建重组质粒； (2)采用所述重组质粒转染细胞， 得到 重组细胞； (3)将重组细胞和慢病毒包 装质粒共同培 养， 得到慢病毒样颗粒的培 养液； (4)将慢病毒样颗粒的培 养液感染宿主细胞， 筛 选得到稳定株， 培 养后获得细胞系。 3.如权利要求2所述的构建方法， 其特 征在于， 步骤(1)包括： (1.1)采用如权利要求1或如权利要求2所述的引物组合对NS1基因进行PCR扩增； (1.2)将PCR扩增产物与经过酶切得到的PSE5519载体同源重组， 并转化进入DH5α 感受 态细菌； (1.3)将DH 5α 感受态细菌进行 单克隆细菌扩增培 养， 分离得到P SE5519‑NS1重组质粒。 4.如权利要求3所述的构建方法， 其特征在于， 步骤(1.2)中， 采用BamHI ‑HF和XhoI对 PMT406载体进行酶切， 回收85 37bp载体片段， 得到P SE5519载体。 5.如权利要求2所述的构建方法， 其特 征在于， 步骤(2)中， 所述细胞为BHK ‑21细胞。 6.如权利要求2所述的构建方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述慢病毒包装质粒为 pCMV‑dR8.9质粒和pC MV‑VSV‑G质粒。 7.如权利要求2所述的构建方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 所述宿主细胞为BHK ‑21细 胞。 8.质粒， 其特 征在于， 其 为如权利要求3所述的P SE5519‑NS1重组质粒。 9.成套质粒， 其特征在于， 其包括如权利要求3所述的PSE5519 ‑NS1重组质粒和如权利 要求6所述的pC MV‑dR8.9质粒、 pC MV‑VSV‑G质粒。 10.如权利要求2所述的构建方法构建得到的细胞亚系下述(1)～(3)任一项中的应用： (1)制备和/或筛 选治疗鸭坦布苏病毒的药物； (2)制备用于预防鸭坦布苏病毒的疫苗； (3)用于检测鸭坦布苏病毒病毒的试剂盒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074389 A 2稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系 的构建方法及其 应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物工程技术领域， 尤其涉及尤其涉及一种稳定表达鸭坦布苏病毒 NS1蛋白的细胞系的构建方法及其应用。 背景技术 [0002]鸭坦布苏病毒(DTMUV)是一种能使感染禽类表现出减蛋综合征为主要症状的致病 因子， 它感染的宿主包括鸡、 鸭、 鹅、 麻雀和鸽子。 2010年上旬， DTMUV病最先在我国东南部地 区爆发， 并且在较短的时间内快速蔓延到中部乃至全国各地的鸭养殖地区。 肉鸭感染后主 要表现为共济失调， 生长缓慢、 精神萎靡、 食欲废绝； 感染 蛋鸭主要表现为产蛋率长期低下， 就算恢复后产下的种蛋的受精率和孵化率也会受到影响； 感染病鸭临床症状表现为拉青色 稀便， 伴有四肢瘫痪， 甩头等神经症状， 死亡率为5％ ‑25％。 病鸭剖检后 :肝脏有出血及稍微 肿大； 脾脏有均匀的如针尖状白色坏死点； 卵巢会因感染时长的不同表现出出血、 萎缩、 坏 死、 龟裂； 病理性切片观察可诊断为出血性卵巢炎。 目前， DTMUV主要流行于我国大部 分的养 鸭养鹅地区， 给中国的水禽养殖业造成巨大的经济损失。 [0003]NS1的分子量约为40kDa， 由352个氨基酸组成。 主要存在于感染的细胞内， 但也可 定位于细胞表面， 可由细胞中缓慢分泌。 在宿主信号肽酶的作用下， NS1易位到内质网中并 从E蛋白中分离出来， 该过程中， 宿 主的蛋白酶也有参与。 有研究认 为NS1在病毒复制的早期 起作用， NS1和NS4A通过互作一同参与了RNA复制。 NS1蛋白也属于病毒的主要抗原， 能诱导 细胞产生非中和抗体， 同时伴随着补体反应。 NS1能抑制宿主细胞I型IFNs 的诱导来拮抗天 然免疫反应， 为病毒复制创造有利条件。 该细胞系过表达NS1 蛋白， 可用于后续NS1蛋白功能 互作方面的研究。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题在于， 提供一种稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细 胞系的构建方法及其应用， 其可 稳定的表达NS1蛋白。 [0005]为了解决上述技术问题， 本发明提供了一种用于钓取鸭坦布苏病毒中NS1基因的 引物组合， 其特征在于， 包括引物一和引物二， 所述引物一为核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所 示的DNA分子； 所述引物二 为核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示的DNA分子 。 [0006]相应的， 本发明还公开了一种稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系的构建方 法， 其包括： [0007](1)采用上述的引物组合构建重组质粒； [0008](2)采用所述重组质粒转染细胞， 得到 重组细胞； [0009](3)将重组细胞和慢病毒包 装质粒共同培 养， 得到慢病毒样颗粒的培 养液； [0010](4)将慢病毒样颗粒的培养液感染宿主细胞， 筛选得到稳定株， 培养后获得细胞 系。说　明　书 1/11 页 3 CN 115074389 A 3