(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210577673.8 (22)申请日 2022.05.25 (71)申请人 山东信达基因科技有限公司 地址 262200 山东省潍坊市诸城市开发区 舜耕路东首半岛慧谷 申请人 山东信得科技股份有限公司 (72)发明人 赵永伟　苗昱　李焕明　马广斌　 王方山　王学娟　邢杰　梁雨欣　 宋红彬　宋美莹　宋金栋　 (74)专利代理 机构 北京同辉知识产权代理事务 所(普通合伙) 11357 专利代理师 于晶晶 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 禽流感病毒检测引物探 针组及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了禽流感病毒检测引物探针组 及试剂盒， 引物探针组包括H5、 H 7、 H9亚型和通用 型检测引物和探针。 该检测引物和探针是针对禽 流感病毒H5、 H7、 H9亚型和通用型高度保守且各 型间存在较大差异的基因分别设计， 可采用单管 一步法四重实时荧光定量RT ‑PCR， 实现单管内一 次反应同时检测出禽流感病毒H5、 H7、 H9亚型和 通用型的效果， 不仅极大地节省了试剂耗材， 缩 短了检测时间， 而且依然具有极高的特异性和灵 敏性。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 114921591 A 2022.08.19 CN 114921591 A 1.禽流感病毒检测引物探针组， 其特征在于， 包括H5、 H7、 H9亚型和通用型检测引物和 探针， 其核苷酸序列如下 所示： 通用型检测引物： SEQ  ID NO:1～2， 通用型检测探针： SEQ  ID NO:3； H5亚型检测引物： SEQ  ID NO:4～5， H5亚型检测探针： SEQ  ID NO:6； H7亚型检测引物： SEQ  ID NO:7～8， H7亚型检测探针： SEQ  ID NO:9； H9亚型检测引物： SEQ  ID NO:10～1 1， H9亚型检测探针： SEQ  ID NO:12； 所述检测探针的5 ’端标记荧光基团， 3 ’端标记淬灭基团， 同一检测体系中不同检测探 针标记的荧 光基团不同。 2.根据权利要求1所述的引物探针组， 其特征在于， 所述检测探针5 ’端标记的荧光基团 如下所示： 通用型检测探针： ROX， H5亚型检测探针： FAM， H7亚型检测探针： H EX， H9亚型检测探针： Cy5 。 3.禽流感病毒检测试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1或2所述的检测引物探针组。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括PCR反应液和 酶混合液， 所述PCR 反应液包括 一步法荧光PCR缓冲液、 Ol igo dT Primer、 Mg2+及dNTP。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述酶混合液包括热启动酶、 反转录酶 和RNA酶抑制剂。 6.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述检测引物探针的浓度均为10μmol/ L。 7.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒适用的样品为咽喉拭子、 泄 殖腔拭子、 组织、 禽胚尿囊液或细胞培 养物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921591 A 2禽流感病毒检测引物探针组及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及禽流感检测技术领域， 具体涉及一种适用于一步法多重荧光定量PCR 的禽流感病毒检测引物探针组及试剂盒。 背景技术 [0002]禽流感病毒(Avian  Influenza Virus,AIV)属于正黏病毒 科、 流感病毒属的RNA病 毒， 可引起禽类从呼吸系统感染到严重全身败血症等多种症状； 鸡、 火鸡、 鸭和鹌鹑等家禽 均可感染， 发病情况差别较大， 有的出现急性死亡， 有的无症状带毒。 禽流感病毒屡次暴发 不仅给养殖业带来巨大 的损失， 同时某些禽流感病毒亚型也严重威胁着人类健康。 家禽中 流行的主要有H5、 H6、 H7、 H9等亚型。 H5和H7亚型的某些毒株可以造成禽类很高的发病率和 死亡率， 被称为高致病性禽流 感(HPAI)病毒。 OIE将高致病性禽流 感列为A类动物疫病， 我国 也将其列为一类动物疫病。 H9亚型禽流感并未被规定为高致病性禽流感， 往往被人们所忽 视， 从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。 此外， 有研究显示H9 N2亚型禽流感病毒在 全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产 生新型的禽 流感病毒。 [0003]我国是一个人口大国， 高致病性禽流感严重威胁了国民经济和人民健康， 因此大 力发展快速、 灵敏的禽流感病毒检测方法， 对我国及 全球防控禽流感的传播具有重要意义。 目前对于禽流感的诊断主要包括对病毒抗原、 流感特异性血清的检测和分子生物学检测。 病毒分离及鉴定常用方法是鸡胚培养分离法； 血清学检测包括血凝抑制试验(HI)、 神经氨 酸酶抑制试验(NI)和酶联免疫吸附测定(ELISA)等可对病毒抗体进行亚型鉴定。 病毒分离 及鉴定耗时费力， 不利于快速检测； HI和NI灵敏度低， 而且操作过程复杂； ELISA特异性和稳 定性好， 但重复性差会受到自身抗体干扰， 影响检测结果。 分子技术诊断方法具有高特异 性、 高敏感性、 快速省时等优点， 主要包括普通PCR、 荧光PCR等， 普通PCR与荧光PCR相比检测 步骤冗长， 可能会出现交叉污染， 而且不能准确定量。 目前较多的禽流感病毒荧光PCR检测 方法仅包括甲型通用和H5、 H7、 H9的单重荧光RT ‑PCR方法， 可检测禽流 感通用病毒并同时进 行H5、 H7、 H9亚型分型的荧 光PCR方法未 见报道。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种适用于一步法多重荧光定量PC R的禽流感病毒检测引物 探针组及试剂盒， 具有灵敏度高， 特异性、 重复性 好， 检测省时省力的优点。 [0005]本发明技 术方案详述如下： [0006]第一方面， 本发明提供了禽流感病毒检测引物探针组， 包括H5、 H7、 H9亚型和通用 型检测引物和探针， 检测探针的5 ’端标记荧光基团， 3 ’端标记淬灭基团， 同一检测体系中不 同检测探针标记的荧光基团不同。 各 组检测引物和探针是针对禽流感病毒H5、 H7、 H9 亚型和 通用型高度保守且各型间存在较大差异的基因分别 设计， 特异性非常高； 通过标记不同荧 光基团， 可以采用单管一步法四重实时荧光定量RT ‑PCR， 实现单管内一次反应同时检测出说　明　书 1/5 页 3 CN 114921591 A 3