(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210731716.3 (22)申请日 2022.06.25 (71)申请人 青海省农林科 学院 地址 810016 青海省西宁市城北区宁大路 253号 (72)发明人 张得芳　于倩　史文君　 (74)专利代理 机构 青海省专利服 务中心 6 3100 专利代理师 雷占兰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因、 专用引物及其筛 选方法和应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 具体涉及盐胁 迫 下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因、 专用引物及 其筛选方法和应用， 通过对现有的5个候选内参 基因在不同盐分浓度的两种枸杞中的荧光定量 分析， 利用三种软件(GeNorm、 NormFinder、 BestKeeper)分析， 筛选出不 同浓度下两种枸杞 中均稳定表达的内参基因， 该内参基因能避免因 为盐分浓度改变而引起的基因的表达不稳定导 致的检测结果差异。 筛选出Actin基因的表达的 稳定性最高， 其表达并没有受到不同胁 迫处理的 影响， 是最适合宁夏枸 杞、 黑果枸 杞qRT‑PCR反应 进行的内参基因， 保证了后续试验结果的可靠 性， 也为后续对相关基因的表达模式分析以及在 盐胁迫条件下的抗逆机制等方面的研究提供理 论指导。 权利要求书2页 说明书7页 序列表4页 附图5页 CN 114959105 A 2022.08.30 CN 114959105 A 1.盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因， 其特征在于， 所述内参基因为Actin； 所述 内参基因Acti n的序列号如SEQ  ID.NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的专用引物， 其特征 在于， 所述内参基因Acti n的引物序列是： F： 5’ ‑CAATCGGGTATTTCAAGGTCAAG‑3’； R： 5’ ‑GAGCAGTGT TTCCCAGCATTG‑3’。 3.根据权利要求1所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的应用， 其特征在 于， 所述盐胁迫下枸杞叶的荧 光定量PCR内参基因在枸杞荧 光定量PCR中应用。 4.根据权利要求3所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的专用引物的应用， 其特征在于， 所述的专用引物在枸杞荧 光定量PCR中应用。 5.根据权利要求1所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的筛选方法， 其特征 在于， 具体步骤 包括如下： 步骤1， 准备材料： 选用长势良好的枸杞组培幼苗， 将根部培养基洗净后移至装有清水 的培养瓶中， 并对枸杞幼苗进行不同盐胁迫处理培养， 每个浓度均设置3次重复， 每瓶培养 瓶内放5～8株幼苗， 处理7d后 分别采样编号， 用液氮速冻后， 放置于 ‑80℃超低温冰箱 中备 用； 步骤2， 总RNA的提取与检测： 称取不同浓度盐胁迫后的冷冻枸杞叶片， 在液氮中充分研 磨， 使用植物植物RNA提取试剂盒提取枸杞叶片部分的总RNA， 通过Nanodrop  OneC超微量分 光光度计对提取的RNA进行浓度和纯度OD值的测定和检验， 筛选出浓度大于100ng ·μL‑1且 A260/280在2.0～2.2的RNA样品， 并用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性对其浓度纯度 进行验证； 步骤3， 合成cD NA第一链： 使用PrimeScript  TM RT Master Mix Perfect Real Time试 剂盒将总RNA反转录合成为cDNA， 反应使用10μL体系： 5 ×PrimeScript  RT Master Mix  Perfect Real Time 2 μL、 总RNA模板根据浓度计算， 浓度≤500ng、 RNase  Free dH2O补充到 10 μL， 反应条件为： 37℃反转录反应15min， 85℃反转录酶的失活反应5s， 将反转录后的cDNA 放置于‑20℃冰箱中， 备用； 步骤4， 引物设计： 根据枸杞的其他现有研究中筛选出5个茄科植物常用的内参基因 GAPDH、 Actin、 EF1α、 UBI、 18S为候选内参基因， 基于候选内参基因的序列信息， 使用 Primer5.0软件设计引物并合成， 长度20～ 25bp， CG为 45～55％； 步骤5， PCR验证及qRT ‑PCR反应： 通过普通PCR验证引物的特异性， 以所有候选内参基因 的cDNA为模板进行普通PCR扩增， 反应体系为25 μL， 其中包括： 作为模板的第一链cDNA1μL， Premix TaqEx Taq Version 2.0plus dye12.5 μL， 上游引物 0.5 μL， 下游引物 0.5 μL， 引物使 用前稀释到20 μM， 灭菌水10.5 μL； 反应程序： 95℃预变性3min； 95℃变性30s、 60℃退火30s、 72℃延伸1min、 共35个循环、 72℃后延伸5min， 再通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进 行特异性验证； 然后根据电泳检测结果， 以枸杞cDNA为模板， 根据设计的引物进行qRT ‑PCR 反应； 步骤6， 分析内参基因的表达稳定性： 分析qRT ‑PCR反应结果中的周期阈值Ct， 分析候选 内参基因的稳定性， 并对 结果绘制统计图， 评估其是否适宜用作荧光定量P CR反应的内参基权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114959105 A 2因； 使用RefFinder平台基于GeNorm、 Normfinder和BestKeeper软件算法对5个候选基因 的 试验结果进行计算验证， 综合各 方法得到最 为准确、 合适的内参基因。 6.根据权利要求5所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的筛选方法， 其特征 在于， 所述步骤1中， 枸杞为宁夏枸杞和黑果枸杞； 所述不同盐胁迫处理为0， 100， 200， 300， 400mmol·L‑1NaCl溶液。 7.根据权利要求5所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的筛选方法， 其特征 在于， 所述 步骤2中植物植物RNA提取 试剂盒为TaKaRa  MiniBEST。 8.根据权利要求5所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的筛选方法， 其特征 在于， 所述步骤5中， qRT ‑PCR反应在qRT ‑PCR仪上进行； 反应以2 μL枸杞第一链cDNA为模板， 加入TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)2×12.5 μL、 P CR正向引物1 μL、 P CR反 向引物1 μL、 灭菌水8.5 μL， 共2 5 μL体系， 引物使用前稀释到10 μM； 反应程序为： 95℃15min； 95 ℃10s、 60℃30s、 72℃30s、 循环50 次； 熔解曲线分析模 式设置为从65℃逐渐升至95℃， 升温 速度为0.1℃/s。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114959105 A 3