(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211192619.8 (22)申请日 2022.09.28 (71)申请人 苏州康唯纳思生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市工业园区东旺 路8号七号楼 A幢5楼 (72)发明人 黄学文　唐磊　 (74)专利代理 机构 苏州智远 浅行知识产权代理 事务所(普通 合伙) 32693 专利代理师 郭海涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 甲、 乙型流 感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒 及使用方法 (57)摘要 本发明公开了一种甲、 乙型流 感病毒和腺病 毒核酸检测试剂盒及使用方法， 属于生物技术领 域。 检测试剂盒中包括分别针对甲型流感病毒的 MatrixProtein基因、 乙型流感病毒的 Ma trixProtein基因 和腺 病毒核酸的 hexonProtein基因设计得到 的引物和探针的组 合， 还包括用于内标的人Actin基因检测的引物 和探针。 本发 明的检测试剂盒能够同时有效检测 甲、 乙型流感病毒和腺病毒， 引物和探针针对病 原微生物特异性保守序列进行设计， 因此检测特 异性高； 且使用了含有增强剂的PCR反应液， 检测 灵敏度高； 能够为临床提供更可靠的实验证据， 满足临床需要。 权利要求书2页 说明书14页 附图8页 CN 115478119 A 2022.12.16 CN 115478119 A 1.一种甲、 乙型流感病 毒和腺病 毒核酸检测试剂 盒， 用于甲型流感病 毒、 乙型流感病 毒 和腺病毒的同时检测， 其特 征在于： 包括如下引物和探针的组合： 2.如权利要求1所述的检测试剂 盒， 其特征在于： 所述检测试剂 盒中还包括用于内标的 人Actin基因检测的引物和探针， 所述用于内标的人Act in基因检测的引物和探针的序列分 别为： 人Actin基因上游引物序列： 5 ’ ‑GATCCCAGAGGTGCATTA‑3’； 人Actin基因下游引物序列： 5 ’ ‑AGTCCTCCAGATCCTTTG‑3’； 人Actin基因探针序列： 5 ’ ‑Cy5‑CAAGCCAGTTACCATGAGGAATCC‑3’。 3.如权利要求2所述的检测试剂盒， 其特征在于： 所述检测试剂 盒中还包括PCR增强剂， 所述PCR增强剂包括硫酸铵、 β ‑环糊精、 Twe en20和BSA中的一种或多种的混合物。 4.如权利要求3所述的检测试剂 盒， 其特征在于： 所述检测试剂 盒中还包括防污染酶混 合液， 所述防污染酶混合液包括dUTP、 UN G酶、 Hotstar  DNA聚合酶、 逆转录酶和RNA酶抑制剂 中的一种或多种的混合物。 5.如权利要求4所述的检测试剂 盒， 其特征在于： 所述检测试剂 盒中还包括阳性对照和 阴性对照， 所述阳性对照包括核酸保护剂、 含甲型流感病毒Matrix  Protein基因的假病毒 颗粒、 含乙型流感病毒Matrix  Protein基因的假病毒颗粒以及含腺病毒hexon  Protein基 因片段的载体的混合物； 所述阴性对照为0.9％的氯化钠溶 液。 6.如权利要求5所述的检测试剂盒， 其特征在于： 所述核酸保护剂包括β ‑巯基乙醇、 二 硫苏糖醇和三(2 ‑羧乙基)膦中的一种或多种的混合物。 7.一种如权利要求6所述的检测试剂盒的使用方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： (1)核酸提取： 对临床 样本进行核酸 提取； (2)预处理： 取出检测试剂盒中的试剂， 融化后离心处 理； (3)配制PCR反应 体系： 配制PCR反应 体系并分配至PCR反应管中； (4)加样： 向步骤(3)的PCR反应管中分别加入临床样本的核酸、 阴性对照和阳性对照， 得到临床 样本反应管、 阴性对照反应管和阳性对照反应管， 然后离心处 理； (5)扩增检测： 将PCR反应管放置在PCR仪中进行扩增检测； (6)结果判断： 对临床 样本的阴 阳性进行判断。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115478119 A 28.如权利要求7 所述的使用方法， 其特 征在于： 步骤(5)的核酸扩增条件为： 9.如权利要求7所述的使用方法， 其特征在于： 步骤(6)需满足以下条件， 才可进行结果 判断， 否则， 本次实验无效， 需重新实验： 所述阴性对照反应管中， FAM、 VIC、 ROX和Cy5通道均无Ct值或Ct值＞40； 所述阳性对照反应管中， FAM、 VIC和ROX通道Ct值均≦3 0， 扩增曲线呈典型 “S”形。 10.如权利要求9所述的使用方法， 其特 征在于： 步骤(6)的结果判断方法为： 所述临床样本反应管中， Cy5通道扩增 出典型“S”形曲线且Ct值≦30， 同时， FAM、 VIC和 ROX通道未检测到扩增曲线或Ct 值＞40时， 报告为甲型流感病毒、 乙型流 感病毒和腺病毒 阴 性； 所述临床样本反应管中， Cy5通道扩增出典型 “S”形曲线且Ct值≦30， 同时， FAM通道检 测到典型的S型扩增曲线且Ct≦37时， 报告为甲型流感病毒阳性； 所述临床样本反应管中， Cy5通道扩增出典型 “S”形曲线且Ct值≦30， 同时， VIC通道检 测到典型的S型扩增曲线且Ct≦37时， 报告为乙型流感病毒阳性； 所述临床样本反应管中， Cy5通道扩增出典型 “S”形曲线且Ct值≦30， 同时， ROX通道检 测到典型的S型扩增曲线且Ct≦37时， 报告为腺病毒阳性； 所述临床样本反应管中， Cy5通道扩增 出典型“S”形曲线且Ct值≦30， 同时， FAM、 VIC或 ROX通道检测到扩增曲线且37＜Ct＜40时， 考虑为相应病原体可疑阳性， 样本需复测后报 告； 所述临床样本反应管中， Cy5通道未扩增出典型 “S”形曲线， 无论FAM、 VIC或ROX通道是 否检测到典型的S型扩增曲线， 本次实验均视为无效， 应查找并排除原因， 并重新实验。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115478119 A 3