(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211272683.7 (22)申请日 2022.10.18 (66)本国优先权数据 202111251797.9 2021.10.25 CN (71)申请人 杭州诺辉健康科技有限公司 地址 310000 浙江省杭州市滨江区长河街 道江二路40 0号2幢13层1313室 (72)发明人 王纯婷　马璐　隋亚鑫　皮潇特　 马昕怡　刘刚　贾卫华　郑小辉　 李锡照　周婷　吕宁　陈一友　 (74)专利代理 机构 北京坤瑞律师事务所 1 1494 专利代理师 封新琴 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6886(2018.01)C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于鼻咽癌诊断的试剂和方法 (57)摘要 本发明公开了多种鼻咽癌诊断标志物， 具体 公开了EB病毒甲基化位点分型以及EB病毒相关 miRNA检测的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的 应用。 本发明提出EB病毒甲基化位点和/或EB病 毒相关miRNA能够作为鼻咽癌诊断标志物， 其在 不依赖临床医生和鼻咽镜引导的鼻咽刷或鼻咽 拭子(鼻咽部盲检)样本中具有高灵敏度和高特 异性的优点， 有利于不依赖临床医生和鼻咽镜引 导的鼻咽刷或鼻咽拭子(鼻咽部盲检)的推广。 权利要求书4页 说明书48页 附图9页 CN 115521996 A 2022.12.27 CN 115521996 A 1.一种用于鼻咽癌检测的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒包 含： (i)核酸甲基化检测试剂， 所述核酸甲基化检测试剂可针对EB病毒基因组中甲基化位 点进行甲基化检测， 所述甲基化位点包含相当于GenBank  LOCUS NC_007605(SEQ  ID NO: 94)的EB病毒基因 组DNA序列的10717bp、 1 1029bp、 和14015bp的位 点； (ii)miRNA检测试剂， 所述miRNA检测 试剂可针对多个来自EB病毒的miRNA进行含量检 测， 所述miRNA包 含EBV‑miR‑BART1‑5p和EBV‑miR‑BART7‑3p； 和 (iii)EB病毒载量检测试剂， 所述EB病毒载量检测试剂包含针对LMP ‑2基因的检测试 剂。 2.如权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述miRNA包含EBV ‑miR‑BART1‑5p、 EBV‑ miR‑BART2‑5p、 EBV‑miR‑BART6‑3p、 EBV‑miR‑BART7‑3p、 EBV‑miR‑BART13‑3p、 和EBV ‑miR‑ BART17‑5p。 3.如权利要求1 ‑2任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含所述样本保存 液， 所述样本保存液包含EDTA， NaCl， 无水乙醇， 柠檬酸钠， NP40， 谷胱甘肽， 和磷酸三钠， 其 中， ‑所述EDTA的含量范围是0.7％ ‑1.5％(w/w)； ‑所述NaCl的含量范围是0.01％ ‑0.1％(w/w)； ‑所述无水乙醇的浓度范围是15％ ‑35％(w/w)； ‑所述柠檬酸钠的含量范围是0.1％ ‑1.0％(w/w)； ‑所述NP40的浓度范围是0.01％ ‑0.1％(v/v)； ‑所述谷胱甘肽的含量范围是0.07％ –0.7％(w/w)； 和 ‑所述磷酸 三钠的含量范围是0.07％ ‑0.4％(w/w)， 所述样本保存液的pH值 为7.6‑8.0。 4.如权利 要求1‑2任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含miRNA提取试剂， 所述miRNA提取 试剂包含裂解液， 结合液， 漂洗液1， 和漂洗液2。 5.如权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述裂解液包含硫氰酸胍， 柠檬酸， 曲拉 通‑100， 和EDTA， 其中： ‑所述硫氰酸胍的含量范围是28％ ‑40％(w/w)； ‑所述柠檬酸的含量范围是1.8％ ‑2.6％(w/w)； ‑所述曲拉通 ‑100的含量范围是0.8％ ‑1.6％(w/w)； ‑所述EDTA的含量范围是0.5％ ‑0.9％(w/w)； 和 ‑所述裂解液的pH值范围为3.8 ‑4.2， 所述结合液包含氯化镁， 乙二胺四乙酸二钠， 碳酸氢钠， 硫氰酸胍， 十二烷基肌氨酸钠， 和异丙醇， 其中： ‑所述氯化镁的含量范围是0.1％ ‑0.4％(w/w)； ‑所述乙二胺四乙酸 二钠的含量范围是0.5％ ‑1.0％(w/w)； ‑所述碳酸氢钠的含量范围是0.6％ ‑1.0％(w/w)； ‑所述硫氰酸胍的含量范围是13％ ‑16％(w/w)； ‑所述十二 烷基肌氨酸钠的含量范围是1.0％ ‑1.4％(w/w)； ‑所述异丙醇的含量范围是6 0％‑80％(w/w)； 和权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 115521996 A 2‑所述结合液的pH值范围是4.8 –5.2， 所述漂洗液1包含乙二胺四乙酸二钠， 碳酸氢钠， 硫氰酸胍， 和十二烷基肌氨酸钠， 其 中， ‑所述乙二胺四乙酸 二钠的含量范围是0.4％ ‑0.9％(w/w)； ‑所述碳酸氢钠的含量范围是0.5％ ‑0.9％(w/w)； ‑所述硫氰酸胍的含量范围是5 0％‑55％(w/w)； ‑所述十二 烷基肌氨酸钠的含量范围是0.8％ ‑1.2％(w/w)； 和 ‑所述漂洗液1的pH值范围是6.2 ‑6.6， 所述漂洗液2包 含三羟甲基氨基甲烷(Tris)和氯化钠， 其中： ‑所述三羟甲基氨基甲烷(Tris)的含量范围是0.5％ ‑0.7％(w/w)； ‑所述氯化钠的含量范围是0.6％ ‑1.8％(w/w)； 和 ‑所述漂洗液2的pH值范围是6.6 –7.0。 6.如权利要求1 ‑2任一项所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包含鼻咽刷或鼻咽 拭子， 所述鼻咽刷和/或鼻咽拭子为不依赖临床医生和鼻咽镜引导的鼻咽刷和/或鼻咽拭 子。 7.如权利要求1 ‑6任一项所述的试剂盒在制备 鼻咽癌检测的产品的用途。 8.一种检测样本中EB病毒相关核酸的方法， 其特 征在于， 所述方法包 含以下步骤： (a)将所述样本 置于样本保存液中； (b)进行以下的检测： (b‑1)对含有所述样本的所述样本保存液进行EB病毒基因 组核酸甲基化检测； (b‑2)从所述样本保存液中提取EB病毒相关 miRNA并对所述miRNA的含量进行检测； 和 (b‑3)对含有所述样本的所述样本保存液进行EB病毒 核酸载量检测， 其中， 所述甲基化检测的甲基化位点包含相当于GenBank  LOCUS NC_007605(SEQ  ID  NO:94)的EB病毒基因组DNA序列的10717bp、 11029bp、 和14015bp 的位点， 所述miRNA包含 EBV‑miR‑BART1‑5p和EBV‑miR‑BART7‑3p， 所述EB病 毒载量检测试剂包含针对LMP ‑2基因的 检测。 9.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述miRNA包含EBV ‑miR‑BART1‑5p、 EBV‑miR‑ BART2‑5p、 EBV‑miR‑BART6‑3p、 EBV‑miR‑BART7‑3p、 EBV‑miR‑BART13‑3p、 和EBV ‑miR‑ BART17‑5p。 10.如权利 要求8‑9任一项所述的方法， 其特征在于， 提取所述EB病毒相关miRNA的步骤 包含： i)向所述样本保存液中加入裂解液； 优选地， 还加入蛋白酶K； ii)加入结合液与核酸吸附材 料； iii)去除液体部分， 向核酸吸附材 料加入漂洗液清洗； 和 iv)去除液体部分， 向所述核酸吸附材料中加入洗脱液， 将所述miRNA从所述核酸吸附 材料中洗脱。 11.如权利要求10所述的方法， 其中： 所述裂解液包 含硫氰酸胍， 柠檬酸， 曲拉通 ‑100， 和EDTA， 其中： ‑所述硫氰酸胍的含量范围是28％ ‑40％(w/w)；权　利　要　求　书 2/4 页 3 CN 115521996 A 3