(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210641725.3 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 南方医科 大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙 太南 路1023号-10 63号 (72)发明人 田恩伟　刘银榕　晁志　 (74)专利代理 机构 北京市诚辉律师事务所 11430 专利代理师 范盈　姚幸茹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于鉴定当归补血丸中生物组分的SNP位点 及鉴定方法 (57)摘要 本发明公开了用于鉴定当归补血丸中生物 组分的SNP位点及鉴定方法。 本发明公开了用于 鉴定当归补血丸中生物组分当归和/或黄芪的 SNP位点和用于识别上述SNP位点的特异性引物 及其应用。 本发明提供的鉴定方法为基于上述 SNP位点或使用上述特异性引物鉴定当归补血丸 中的生物组分。 本发明分别基于当归及其混伪 品、 黄芪及其混伪品变异位点丰富的ITS基因片 段设计特异性鉴别引物， 利用特异性多重PCR技 术同时定性鉴别当归补血丸中两个生物组分： 当 归和黄芪， 以期为当归补血丸及其他含有当归 和/或黄芪的中成药的质量控制提供新思路。 权利要求书2页 说明书19页 序列表2页 附图4页 CN 115044698 A 2022.09.13 CN 115044698 A 1.一种用于鉴定当归补血丸中生物 组分的SNP位点， 其特征在于， 所述生物 组分包括当 归和/或黄芪； 所述当归的SNP位点选自SEQ  ID NO.1所示的从5 ’端起的第63位点、 65位点、 67位点、 72 位点、 74位点、 78位点、 80位点、 398位 点、 403位点和409位 点中的至少一个； 所述黄芪的SNP位点选自SEQ  ID NO.2所示的从5 ’端起的第41位点、 43位点、 46位点、 48 位点、 49位点、 51位点、 52位点、 53位点、 54位点、 55位点、 56位点、 57位点、 58位点、 59位点、 489位点、 490位点、 491位点、 495位点、 497位点、 501位点、 502位点、 和503位点中的至少一 个。 2.用于识别权利要求1所述的SNP位 点的特异性引物。 3.根据权利要求2所述的特异性引物， 其特征在于， 所述特异性引物包括下述特异性引 物对中的任意 一对： 当归特异性引物对： 如SEQ ID NO.3所示的上游引物： 5'G GCTTTGGTCCCTTGTATG 3'； 如SEQ ID NO.4所示的下游引物： 5'CACGAG GAGTGAGTG GTTG 3'； 黄芪特异性引物对： 如SEQ ID NO.5所示的上游引物： 5'GCAC CACGACCTCCCTTTG 3'； 如SEQ ID NO.6所示的下游引物： 5'GC CATCATTCGCCCTAAA 3'。 4.权利要求1所述的SNP位点或权利要求2 ‑3任一所述的特异性引物的应用， 其特征在 于， 所述应用为下述(i)～(i i)中的任一种： (i)鉴定待测样品是否为或待测样品中是否含有当归和/或黄芪； (ii)制备用于鉴定待测样品是否为或待测样品中是否含有当归和/或黄芪的试剂盒。 5.一种鉴定当归补血丸中生物 组分的方法， 其特征在于， 所述方法为基于权利要求1所 述的SNP位 点或权利要求2 ‑3任一所述的特异性引物鉴定当归补血丸中的生物组分。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： (1)提取待测样品的基因 组DNA； (2)以提取的待测样品的基因组DNA为模板， 基于上述SNP位点设计特异性引物或利用 上述特异性引物进行PCR扩增反应； (3)检测PCR扩增产物。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述提取待测样品的基因组DNA的方法为 改良CTAB法。 8.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 所述改良CTAB法具体包括如下步骤： S1.取2～3g待测样品进行研磨； S2.将研磨得到的细粉加入至10～15mL  65℃预热的4 ×CTAB提取缓冲液中， 其中， 所述 4×CTAB提取缓冲液 预热前加入千分之二体积的1M的二硫苏糖醇溶 液， 65℃水浴1.5 h； S3.冷却后加入1～1.5倍体积的氯仿 ‑异戊醇混合溶液， 体积比为24： 1， 离心； S4.取上清， 加入0.7～1倍体积 ‑20℃预冷的异丙醇， 置于 ‑20℃下沉降1h， 离心弃掉废 液， 得到粗DNA； S5.将提取到 的粗DNA分别经过70％乙醇溶液和无水乙醇洗涤后， 用通用型DNA纯化回 收试剂盒进行 纯化；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115044698 A 2优选地， 步骤S3 重复2次。 9.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述PCR扩增反应的退火温度 为50℃～67.6℃， 优选为6 5℃； 优选地， 所述PCR扩增反应中： 当归的基因组DNA检出限≥0.04ng/ μL； 黄芪的基因组DNA 检出限≥0.0 04ng/ μL。 10.根据权利要求5所述的方法， 其特 征在于， 所述检测PCR扩增产物为电泳检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115044698 A 3