(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210646716.3 (22)申请日 2022.06.09 (71)申请人 湖北省药品监 督检验研究院 地址 430075 湖北省武汉市东湖高新 技术 开发区高新大道6 66号 (72)发明人 汪波　胡敏　徐玲　王文斌　 李小芳　程华春　莫静　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 徐绍新 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 用于鉴定中药材人参和西 洋参的rhPCR引物 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于鉴定中药材人参和 西洋参的rhPCR引物， 包括人参左引物、 西洋 参左 引物和共同右引物， 所述引物的碱基序列如SEQ   ID NO:1‑3所示。 本发明还公开了一种鉴定中药 材人参和西 洋参的rhPCR方法， 包 括以下步骤： 1) 提取样品基因组DNA； 2)利用所述的引物对样品 基因组DNA进行rhPCR扩增； 3)收集熔解曲线信 号， 分析Tm值判断是否有人参或西 洋参的DNA 。 本 发明能够在较短的时间内快速鉴别中药材人参 和西洋参， 该方法具有特异性强， 灵敏度高等优 点。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图5页 CN 115011592 A 2022.09.06 CN 115011592 A 1.用于鉴定中药材人参和西洋参的rhPCR引物， 其特征在于： 包括人参左引物、 西洋参 左引物和共同右引物， 所述引物的碱基序列如下： 人参左引物R ‑F： 5'‑CAATACCGGGCTGATT/rC/AGTC‑3'‑C3 Spacer； 西洋参左引物X ‑F： 5'‑GCGCCAGGTCCAATACCGGGCTCAGT/rG/AGTC ‑3'‑C3Spacer； 共同右引物R： 5' ‑GCGGCTGCTGGCACCAGACTTG‑3'； 其中， /rC/代表胞嘧啶核糖核苷酸， /rG/代表鸟嘌呤核糖核苷酸， G代表鸟嘌呤脱氧核 糖核苷酸， C代 表胞嘧啶脱氧核糖核苷酸。 2.权利要求1所述的rhPCR引物在鉴定中药 材人参和西洋参中的应用。 3.一种鉴定 中药材人参和西洋参的试剂 盒， 其特征在于： 该试剂 盒含有权利要求1所述 的rhPCR引物。 4.如权利要求3所述的试剂盒， 其特 征在于： 该 试剂盒还 含有耐热RNase  H2酶。 5.一种鉴定中药 材人参和西洋参的rhPCR方法， 其特 征在于包括以下步骤： 1)提取样品基因 组DNA； 2)利用权利要求1所述的引物对样品基因 组DNA进行rhPCR扩增； 3)收集熔解曲线信号并分析Tm值， 判断是否有人参或西洋参的DNA。 6.如权利 要求5所述鉴定中药材人参和 西洋参的rhPCR方法， 其特征在于， 步骤2)中， 所 述rhPCR扩增的反应 体系为： 7.如权利 要求5所述鉴定中药材人参和 西洋参的rhPCR方法， 其特征在于， 步骤2)中， 所 述rhPCR扩增的反应程序为： 95℃预变性5mi n； 95℃变性10s， 58℃延伸3 0s， 循环25次。 8.如权利 要求5所述鉴定中药材人参和 西洋参的rhPCR方法， 其特征在于， 步骤3)中， 通 过观测样品的Tm值进行鉴定， 若熔解曲线的Tm值为81.3℃ ±0.1℃， 则样品中含有人参DNA， 该样品为人参； 若 熔解曲线的Tm值为82.8℃ ±0.1℃， 则样品中含有西洋参DNA， 该样品为西 洋参； 若在81.3℃ ±0.1℃和82.8℃ ±0.1℃分别出峰， 则样品中同时含有人参和西洋参 DNA， 该样品为人参与西洋参混合药 材。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011592 A 2用于鉴定中药材人参和西洋参的r hPCR引物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于中药材鉴定领域， 具体涉及一种鉴别中药材人参和西洋参的rhPCR引 物， 本发明还涉及该引物的应用以及一种快速鉴定中药 材人参和西洋参的rhPCR方法。 背景技术 [0002]人参(gingseng  radix et rhizoma)为五加科植物人参(Panax  ginseng   C.A.Meyer)的干燥根和根茎。 西 洋参(panaci s quinquefolii  radix)为五加科植物西 洋参 (Panax quinquefolius  L.)的干燥根。 两种药材同为五加科名贵中药材， 主产区主要分布 在亚洲和北美洲。 人参微 温， 味甘， 苦味稍浓， 具有燥湿助阳的作用。 西洋参性凉， 味甘， 苦味 较弱， 能够清热养阴， 生津止渴。 但是， 两个物种的活性 成分如人参皂苷、 挥发油、 氨基酸、 糖 类等物质种类相似但含量不同。 如西洋参皂苷总量高于人参， 但部分种类的皂苷含量低于 人参， 两个物种中的多糖含量也存在差异， 这势必 会引起两种中药材功效差异。 如果误用两 种药材， 会适得其反甚至会加重病情。 [0003]由于人参、 西洋参为近缘物种， 其性状高度相似， 但两种药材的价格相差较大， 尤 其市售的粉末商品存在混伪， 使用传统的鉴定方法很难区分粉末状态下 的两种药材， 会严 重影响用药安全。 人参与西洋参全株根茎在形态上虽有差异， 但经干燥切制或以粉末入药 时， 难以通过外观 性状、 显微特征比较和化学成分分析正确有效区分。 因此开 发快速准确鉴 别人参及西洋参的方法对安全用药 具有重要意 义。 发明内容 [0004]本发明的第一个目的是为了解决中药材人参、 西洋参混用的难题， 提供一种快速 鉴别人参和西洋参的rhPCR引物。 [0005]本发明采用核糖核酸酶依赖性PC R(rhPCR)方法， 针对中药材人参和西洋参的核基 因片段序列设计特异 性引物， 所设计的特异 性rhPCR引物由人参左引物、 西洋参左引物和共 同右引物组成， 所述引物的碱基序列如下： [0006]人参左引物R ‑F： 5'‑CAATACCGGGCTGATT/rC/AGTC‑3'‑C3 Spacer(SEQ  ID NO:1)； [0007]西洋参左引物X ‑F： 5'‑GCGCCAGGTCCAATACCGGGCTCAGT/rG/AGTC ‑3'‑C3Spacer(SEQ   ID NO:2)； [0008]共同右引物R： 5' ‑GCGGCTGCTGGCACCAGACTTG‑3'(SEQ ID NO:3)。 [0009]其中， /rC/代表胞嘧啶核糖核苷酸， /rG/代表鸟嘌呤核糖核苷酸， G代表鸟嘌呤脱 氧核糖核苷酸， C代 表胞嘧啶脱氧核糖核苷酸。 [0010]特别地， 所述西洋参左引 物序列中斜体部分为人为设计 的填充序列， 目的是改变 其熔解温度而不影响其扩增。 应当说明的是， 使用源自深海火球菌(Pyrococcus  abyssi, P.a.)的RNase  H2酶能够将完全匹配的RNA ‑DNA中的RNA碱基切除的特点， 在设计的引物中 引入的核糖核苷酸只有在与靶序列互补配对的情况下， 才 能被RNase  H2酶切割， 从而引物 能继续向后 延伸， 成功完成扩增反应； 反之， 则扩增失败。 另外， 在上游引物3'端加入封闭基说　明　书 1/7 页 3 CN 115011592 A 3