(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211366562.9 (22)申请日 2022.11.03 (71)申请人 甘肃康承利新 生物科技 开发有限公 司 地址 730100 甘肃省兰州市榆中县兰州高 新技术产业开发区定连园区金科路西 侧兰州国家 生物医药基地5号楼1单元 3层301室 (72)发明人 康鹏天　陈智　刘荭　高文慧　 石岩　金静　王秀琴　金凡力　 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 检测的引物和探 针、 试剂、 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明属于基因检测技术领域， 涉及一种用 于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 检测 的引物和探针、 试剂、 试剂盒及应用。 本专利通过 特异性引物、 特异性荧光探针、 5种工程酶、 其它 化学组分的共同作用下， 在具备荧光检测功能的 仪器中实现核酸目标物的快速检测， 并通过严格 的实验操作步骤保证闭管检测， 有效防止气溶胶 污染， 同时进行了利用了较轻便的荧光检测设 备， 实现了野外， 塘边快读检测的效果， 大大减少 实验环节复杂性， 并快速解决实验开展问题。 权利要求书1页 说明书7页 附图5页 CN 115491439 A 2022.12.20 CN 115491439 A 1.一种用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 检测的引物和探针， 其特征在于， 引物序列为： 上游引物IHNV ‑F1： ACCTTCGCAGAY CCCAACAACAAGCTTGCA； 下游引物IHNV ‑R1： CTGGTTGCAAGACGCTCGAGCT TGTTTTGG； 探针序列为： IHNV ‑Probe： AACGATCGKAAAGGAAAATGTCCTTGAGG/i6FAM ‑dT/T/idSp//iBHQ1 ‑dT/GACCGGCCTCCTCTT， 其中， F为 荧光基团， H为四氢呋喃， B为淬灭基团，  3’末端标记C 3间臂。 2.根据权利要求1所述用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病 毒 （IHNV） 检测的引物和探针 在虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 检测试剂或试剂盒中的应用。 3.根据权利要求2所述的用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 检测试剂， 其特 征在于， 所述试剂包括聚乙二醇、 Tr is、 乙酸钾、 二硫 苏糖醇、 酸磷酸腺苷、 磷酸肌酸二钠盐、 磷酸肌酶、 脱 氧核糖核苷 三磷酸、 海藻糖、 甘露醇、 重组酶、 单链DNA结合蛋白、 DNA聚合 酶、 辅 助蛋白及核酸外切酶。 4.根据权利要求3所述的用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 检测试剂， 其特 征在于， 所述试剂各组份的浓度范围如下： 聚乙二醇， 2 ‑4%； Tris， 20 ‑40 mM； 乙酸钾， 100 ‑ 140 mM； 二硫苏糖醇， 4 ‑8 mM； 酸磷酸腺苷， 2 ‑4 mM； 磷酸肌酸二钠 盐， 40‑60 mM； 磷酸肌酶， 80‑120 ng/µl； 脱氧核糖核苷三磷酸， 250 ‑300  µM； 海藻糖， 5 ‑8%； 甘露醇， 20 ‑40 ng/µl， 重 组酶520‑725 ng/µl； 单链DNA结合 蛋白100‑200 ng/µl； DNA聚合酶350 ‑450 ng/µl； 核酸外 切酶300‑400 ng/µl。 5.根据权利要求3所述的用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 检测试剂， 其特 征在于， 所述试剂的制备 方法包括： （1） 将反应液在 ‑80°C条件下预冻1～1.5小时得到预冻试剂； （2） 将预冻试剂先置于 ‑35～‑45°C环境下干燥2~10小时， 再置于10~18°C环境下干燥1 ～2小时， 得到冻干粉； （3） 在装有所述试剂的反应管中加待检样本、 双蒸水和缓冲液； （4） 将试剂的反应管置于一温控设备中孵育15～25分钟， 再通过具备荧光检测功能的 仪器进行可视化检测， 检测过程保持反应管密闭， 温控设备保持一恒定温度， 且 该温度范围 为20℃‑42℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115491439 A 2用于虹鳟鱼传染性造血器 官坏死病毒 （IHNV） 检测的引物和探 针、 试剂、 试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因检测技术领域， 具体涉及用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 检测的引物和探针、 试剂、 试剂盒及应用。 背景技术 [0002]虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） (Feline  panleukopenia  virus)隶属于 弹状病毒科诺拉弹状病毒属， 是传染性造血器官坏死病(Infectious  Hematopoietic   NecrosisIHN)的病原体。 IHN是鲑鳟鱼类的一种严重的急性、 传染性病毒病 ”根据鱼的种类、 年龄、 病毒株系以及环境条件的不同，  IHN的爆发可能导致鱼体80%~100%的死亡率12对世 界鲜鱼养殖业造成了重大损失。 目前已成为制约鲑 鱼养殖发展的重要威胁， 由于其 发病急、 发病率高， 已被国际兽医局OIF(Office  International  DesEpizooties)列为必须 申报的 疾病， 被我国列为二类疫病 。 IHNV的生物学特性： IHNV粒子呈典型的弹状大小为(120~300) nmx(60~100)nm.有森膜不 耐热、 不耐酸对甘油、 乙醚游离碘及氯仿敏感， 在50%甘油中保存1 ~2周即失去活力问。 IHNV能在许多鱼类细胞系中增殖， 如大鳞大马哈鱼胚胎细胞系(CHSE ‑ 214)、 虹鳟性腺细胞系(RTG ‑2)鲤鱼上皮瘤细胞系(EPC)胖头肌肉细胞系(FHM)蓝腮太阳鱼 细胞系(BF ‑2)等。 生长温度为 4~20℃， 最适温度为15℃在23~25℃时病毒不复制。 [0003]IHNV主要存在于患病或无症状带病毒的野生及人工养殖的鱼体内。 其传播途径有 2种， 水平传播和垂直传播， 其中水平传播为其主要传播途径， 水平传播主要感染源是苗种 期间患过IHN残留下来的带病毒鱼病毒随着代谢产 物排入水中， 通过直接接触而感染， 无脊 椎动物也在水平传播中起到一定作用。 [0004]目前虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 的诊断方法多为血清学方法和病毒 分离鉴定， 其灵敏度低， 无法对早期感染进行确诊； 而基于PCR的诊断方法耗时长， 技术要求 高， 设备昂贵， 无法普及。 [0005]综上可知， 现有技 术在实际使用上显然存在不便与缺陷， 所以有必要加以改进。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种用于虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 检测的 引物和探针、 试剂、 试剂盒， 其可以对虹鳟鱼传染性造血器官坏死病毒 （IHNV） 进行快速、 实 时、 特异性检测， 适 合应用于多种荧 光检测设备进行检测。 [0007]为了达到上述目的， 本发明首先提供了一种用于虹鳟鱼传染性造血器官坏 死病毒 （IHNV） 检测的引物和探针， 引物序列为： 上游引物IHNV ‑F1： ACCTTCGCAGAY CCCAACAACAAGCTTGCA； 下游引物IHNV ‑R1： CTGGTTGCAAGACGCTCGAGCT TGTTTTGG； 探针序列为： IHNV ‑Probe： AACGATCGKAAAGGAAAATGTCCTTGAGG/i6FAM ‑dT/T/idSp//iBHQ1 ‑dT/说　明　书 1/7 页 3 CN 115491439 A 3