(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210707485.2 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路15 5号 (72)发明人 邱小彤　李振军　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 商秀玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/22(2006.01) (54)发明名称 用于检测肺炎克雷伯菌的核酸分子、 试剂盒 和检测方法 (57)摘要 本发明涉及微生物检测技术领域， 具体涉及 用于检测肺炎克雷伯菌的核酸分子、 试剂盒和检 测方法。 本发 明提供的用于肺炎克雷伯菌检测的 核酸分子包含用于肺炎克雷伯菌检测的LAMP引 物组以及gRNA和ssDNA探针。 上述核酸分子配合 CRISPR‑Cas蛋白能够实现高效、 特异、 灵敏的肺 炎克雷伯菌检测。 本发明还 提供基于CRISPR ‑top 技术检测肺炎克雷伯菌的方法， 特异性可达 100％， 能够实现简单、 快速、 准确的肺炎克雷伯 菌检测。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图7页 CN 115074454 A 2022.09.20 CN 115074454 A 1.用于肺炎克雷伯菌检测的LAMP引物组， 其特征在于， 所述引物组包含核苷酸序列如 SEQ ID NO.1‑5所示的引物。 2.一组用于肺炎克雷伯菌检测的核酸分子， 其特征在于， 所述核酸分子包含权利要求1 所述的用于肺炎克 雷伯菌检测的LAMP引物组以及gRNA和s sDNA探针； 其中， 所述gRNA靶向肺炎克雷伯菌rcsA基因的DNA片段， 所述DNA片段为采用所述LAMP 引物组扩增得到； 所述ssDNA探针为符合Cas12蛋白反式切割原则的单链DNA。 3.根据权利要求2所述的用于肺炎克雷伯菌检测的核酸分子， 其特征在于， 所述gRNA的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示。 4.根据权利要求3所述的用于肺炎克雷伯菌检测的核酸分子， 其特征在于， 所述ssDNA 探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； 和/或， ssDNA探针的5 ’端和3’端分别标记荧光基团和淬灭基团， 或者， ssDNA探针5 ’端 和3’端分别标记荧 光基团和生物素。 5.试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含权利要求2～4任一项所述的用于肺炎克雷伯 菌检测的核酸分子和CRIS PR‑Cas蛋白； 所述CRIS PR‑Cas蛋白具有切割s sDNA或ssRNA的活性。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述CRIS PR‑Cas蛋白为AapCas12b。 7.根据权利要求5或6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包含选自LAMP反应缓 冲液、 Bst 2.0DNA聚合酶、 CRIS PR反应缓冲液和水中的一种或多种。 8.一种基于CRISPR ‑top技术检测肺炎克雷伯菌的非诊断目的的方法， 其特征在于， 所 述方法利用权利要求5～7任一项所述的试剂盒进行检测， 包括： 将 CRISPR‑Cas蛋白、 gRNA与 CRISPR反应缓冲液混合， 经反应得到 CRISPR‑Cas蛋白/gRNA复合物； 将用于肺炎克雷伯菌检测的LAMP引物组、 Bst  2.0DNA聚合酶、 LAMP反应缓冲液、 CRISPR‑Cas蛋白/gRNA复合物、 ssDNA探针与待测样品的DNA混合后于恒温条件下进行 CRISPR‑top反应。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述CRISPR ‑top反应的体系中， 核苷酸序 列如SEQ ID NO.3和4所示的引物的浓度为0.4～1.2 μM,核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示的 引物的浓度为0.2～0.6 μM,核苷酸序列如SEQ  ID NO.1和2所示的引物的浓度为0.1～0.3 μ M； 和/或， 所述CRIS PR‑top反应的体系中， s sDNA探针的浓度为1.2 ～6 μM。 10.根据权利要求8或9所述的方法， 其特 征在于， 所述恒温条件为5 3℃～58℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074454 A 2用于检测肺炎克雷伯菌的核酸分子、 试剂盒和检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及微生物检测技术领域， 具体涉及用于检测肺炎克雷伯菌 的核酸分子、 试剂盒和检测方法。 背景技术 [0002]肺炎克雷伯菌(Klebsiella  pneumoniae,K.pneumoniae)是一种革兰氏阴性杆菌， 是引起呼吸道感染， 特别是医院感染最常见的病原体之一。 近年来， 随着肺炎克雷伯菌多重 耐药菌株和高毒力菌株的出现， 其已成为影响全球公共卫生的重要病原体。 开发快速、 准 确、 方便的检测方法对于肺炎克 雷伯菌感染的早期诊断和治疗具有重要意 义。 [0003]目前， 对肺炎克雷伯菌的检测主要采用基于表型的鉴定方法， 如生化鉴定、 全自动 细菌鉴定系统等。 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI ‑TOF MS)也是鉴别肺炎克 雷伯菌的常用方法。 然而， 这些方法均基于细菌培养， 导致诊断时间较长。 核酸检测是早期 诊断和快速控制传染病传播的关键。 一些基于PCR的分子诊断技术已经被开发用于检测肺 炎克雷伯菌， 并显示出较好的检测效果， 但执行这些检测需要昂贵的精密仪器。 此外， 反应 时间较长(2 ‑4h)是基于PCR的检测方法的另一个限制。 等 温扩增技术是克服基于P CR技术的 方法缺点的理想技术。 环介导等温扩增(loop ‑mediated  isothermal  amplification, LAMP)已广泛应用于病原体 检测。 然而， 相对较高的假阳性结果 率是LAMP检测的一个缺 点。 [0004]近年来， 多个基于CRISPR/Cas(Cluster  regular  Interspaced  Short  Palindro mic Repeats/CRISPR ‑associated)的检测平台被相继开发出来， 并显示出了高灵 敏度和特异性， 例如， 基于CRISP R/Cas12a的DETECTR和HOLMES检测平台， 以及基于CRISPR/ Cas13a的SHERLOCK检测平台在多种病原 体检测中具有单碱基的特异性和aM级别的敏感性。 与基于PCR的检测方法相比， 基于CRISPR的检测可以在恒温(甚至 室温)条件 下进行， 从而减 少了对专业仪器设备的依赖。 此外， 基于CRISPR的方法通常需要一个预扩增步骤来提高检 测灵敏度， 但基于CRISPR 的检测步骤耗时很短(5 ‑10分钟)， 这使得基于CRISPR 的检测方法 与基于PCR的检测方法相比， 总检测时间接 近甚至更少。 [0005]目前， 大多数基于CRISPR的检测方法包括两个独立的步骤， 即(1)使用 扩增技术 (如PCR、 环介导等 温扩增(LAMP)和重组酶聚合 酶扩增(RPA))对目标序列进行预扩增； (2)利 用Cas蛋白的反式裂解活性检测 扩增子。 两步法CRISPR检测较一步法CRISPR检测需要更多 的操作步骤和更长的检测时间。 此外， 预扩增反应管 的开盖操作也增加了检测过程中交叉 污染的风险。 微流控设备与CRISPR/Cas技术的联合以及可逆阀辅助芯片的应用可以解决上 述问题， 但是这些特殊设备意味着更多的经济成本， 因此其应用受到限制。 Cas12aVDet平台 和opvCRISPR平台已被报道分别用于支原体和SARS ‑CoV‑2的检测。 这两个检测平台改进了 基于CRISPR技术的试管内检测， 无需专门的设备。 在这两种方法中， Cas12a被添加在反应管 盖内或管壁上以避免失活， 虽然不需要打开预扩增反应管， 但仍然需要离心和混合步骤。 2021年， Li等人设计了一种新的基于CRISPR的检测技术， 命名为CRISPR ‑top(CRISPR ‑ mediated  testing in one‑pot)。 该技术将LAMP与基于CRISPR/Cas12b的检测结合在一个说　明　书 1/9 页 3 CN 115074454 A 3