(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210578688.6 (22)申请日 2022.05.25 (71)申请人 三亚中国检科院生物安全中心 地址 572025 海南省三 亚市崖州区科技城 标准厂房二期三楼C268区 申请人 中国检验检疫科 学研究院 　 中国农业大 学 (72)发明人 田茜　罗来鑫　赵文军　方雪阳　 马云龙　孙羽佳　 (74)专利代理 机构 北京市中伦律师事务所 11410 专利代理师 信建 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/6844(2018.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 用于检测水稻细菌性谷枯病菌的组合产品 及试剂盒 (57)摘要 本发明涉及分子生物学技术领域， 具体而 言， 涉及一种用于检测水稻细菌性谷枯病菌的组 合产品及试剂盒。 该组合产品包括上游引物、 下 游引物和探针， 可配合等 温核酸扩增体系进行使 用。 本发明所提供的组合产品及试剂盒检测灵敏 度和特异性均较高， 且检测方便， 耗时较短。 权利要求书1页 说明书9页 附图3页 CN 114958835 A 2022.08.30 CN 114958835 A 1.组合产品， 包 含： 上游引物： TCGCTCTC CCGAGGGAGATGACAGC CGCTACA； 下游引物： ACACG GAACACCTGGGTAGTCTCTGTAG GGAAG； 以及 探针： CCATCTCAAATAAGCGCTTCCGCTATCCACTXTACTACT TCTTCCAGAT； 其中所述探针为基于重组酶聚合酶扩增技术的探针， 第31位碱基T标记发光基团， 第32 位X为脱碱基核苷 酸类似物， 第33位碱基T标记淬灭基团， 3 ’端进行阻断剂修饰； 所述阻断剂 用于阻断探针的聚合酶延伸。 2.根据权利要求1所述的组合产品， 所述脱碱基核苷酸类似物为四氢呋喃。 3.根据权利要求1所述的组合产品， 所述阻断剂为间臂， 优选 C3间臂。 4.根据权利要求1所述的组合产品， 所述发光基团为FAM， 所述淬灭基团是BHQ。 5.试剂盒， 其包 含权利要求1～4任一项所述的组合产品。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其还包含核酸提取试剂、 等温核酸扩增所用试剂、 阳 性对照和阴性对照中的一种或多种。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 所述等温核酸扩增所用试剂包括能结合单链核酸的 重组酶、 单链DNA结合蛋白、 链置换DNA聚合酶、 辅助蛋白、 核酸外切酶III、 反转录酶、 ATP、 ATP再生体系所用试剂、 pH调节剂、 dNTP、 各种分子量分布的BSA和/或PEG、 DTT以及水中的一 种或多种； 其中所述辅助蛋白用于改变重组酶 ‑引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程， 使 反应向更有利于等温核酸扩增进行。 8.根据权利要求7 所述的试剂盒， 所述重组酶选自uvsX和/或RecA； 可选地， 所述单链DNA结合蛋白为gp32； 可选地， 所述链置换DNA聚合酶选自BSu  DNA聚合酶和/或Sau  DNA聚合酶； 可选地， 所述辅助蛋白选自uvsY； 可选地， 所述ATP再生体系所用试剂选自镁离子、 磷酸肌酸及其平衡离子、 肌酸激酶、 肌 激酶、 焦磷酸酶、 蔗糖以及蔗糖磷酸 化酶中的一种或多种。 9.根据权利要求6～8任一项所述的试剂 盒， 所述等温核酸扩增所用试剂为冻干粉试剂 或混合的液体试剂。 10.权利要求1～4任一项所述的组合产品， 或权利要求5～9任一项所述的试剂盒在检 测中的应用。 11.根据权利要求1所述的应用， 检测在恒温扩增的条件下进行， 温度为37℃～42℃， 反 应时间≥20mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958835 A 2用于检测水稻细菌性谷枯病菌的组合产品及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 具体而言， 涉及一种用于检测水稻细菌性谷枯 病菌的组合产品及试剂盒。 背景技术 [0002]水稻细菌性谷枯病菌是黄单胞属的革兰氏阴性细菌， 是引起水稻细菌性谷枯病 (bacterial  panicle blight ofrice,BPBR)的病原菌， 该病害最早在日本发现， 目前蔓延 至东南亚， 美洲， 非洲部分地区， (CABI)。 国内2007年首次在无症状谷粒中检出水稻细菌性 谷枯病菌(J.Luo  et.al.,2007)， 2020年首次在南方稻田有症状病叶中检出水稻细菌性谷 枯病菌(Y.Hou  et.al.,2020)， 目前该病害在国内呈零星分布。 在田间接种试验中细菌性谷 枯病可导致高达75％产量损失； 一项美国的研究中证明， 随着全球变暖， 细菌性谷枯病侵染 面积将增大， 导致减产增多， 在3℃升温下， 水稻细菌性谷枯病预计额外造成每年2.04亿美 元损失(Shew  AM et.al.,2019)。 水稻细菌性谷枯病菌严重威胁到粮食安全， 因此将其列入 我国的进境植物检疫性有害生物， 快速准确的检疫检测技术能有效阻止其传播， 保证稻谷 安全生产。 [0003]目前对于水稻细菌性谷枯病菌的检测主要是传统的生物测定， 直接分离以及分子 检测的多聚酶链式反应(PCR)方法实时荧光PCR(qRT ‑PCR)方法和血清学方法， 但PCR和 ELISA方法灵敏度有限， 且耗时较长， qRT ‑PCR依赖昂贵的检测仪器并对环境中的抑制因素 和污染较为敏感， 容 易有假阳性或假阴性。 [0004]重组酶聚合酶扩增技术(RPA)技术是2006年提出的一种新型多酶恒温核酸扩增技 术， 可以快速且便捷 地进行核酸检测分析(Piepenburg  et al.,2006)。 在2 5‑43℃的恒温条 件下， RPA技术能在5 ‑20min内实现特定核酸序列的扩增并观察到结果。 本实验采用的是改 进的RPA技术称为多酶恒温核酸快速扩增技术(MIRA)， 具有更好的稳定性和相同时间更高 的荧光值(Hui Chenet al.,2021)。 发明内容 [0005]本发明的第一目的在于提供一种组合产品， 包 含： [0006]上游引物： TCGCTCTC CCGAGGGAGATGACAGC CGCTACA； [0007]下游引物： ACACG GAACACCTGGGTAGTCTCTGTAG GGAAG； 以及 [0008]探针： CCATCTCAAATAAGCGCTTCCGCTATCCACTXTACTACT TCT TCCAGAT； [0009]其中所述探针为基于重组酶 聚合酶扩增技术的探针， 第3 1位碱基T标记发光基团， 第32位X为脱碱基核苷 酸类似物， 第33位碱基T标记淬灭基团， 3 ’端进行阻断剂修饰； 所述阻 断剂用于阻断探针的聚合酶延伸。 [0010]本发明的第二目的在于提供 试剂盒， 其包 含如上所述的组合产品。 [0011]本发明的第三目的在于提供如上所述的组合产品， 或如上所述的试剂盒在检测水 稻细菌性谷枯病菌中的应用。说　明　书 1/9 页 3 CN 114958835 A 3