(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210754426.0 (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 杭州博拓生物科技股份有限公司 地址 311121 浙江省杭州市余杭区中泰街 道富泰路17号 (72)发明人 叶春生　吴淑江　董大陆　吴丹娜　 吴海波　杨帆　 (74)专利代理 机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 专利代理师 朱莹莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于检测H4亚型禽流感病毒的特异性引物 和探针及其应用 (57)摘要 本发明公开一种用于检测H4亚型禽流感病 毒的特异性引物和探针及其应用。 本发明提供的 试剂盒， 使用H4亚型禽流感病毒血凝素基因特异 性引物和探针， 通过一步 法荧光定量RT ‑PCR快速 检测H4亚型禽流感病毒， 反应在一管内完成， 操 作方便， 并降低了污染风险， 实现H4亚型禽流感 病毒的快速检测。 本发明具有操作简单、 检测时 间短、 特异性强、 准确率高等优点。 本发 明为临床 样本中H4亚型禽流感病毒感染的辅助诊断提供 了有效的工具， 并可推广应用于临床和实验研 究。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 115125333 A 2022.09.30 CN 115125333 A 1.检测H4 亚型禽流感病毒的特异性引物和探针， 其特 征在于， 所述特异性引物为H4 ‑F和H4‑R， 如SEQ ID NO： 1‑2所示： H4‑F的序列信息： 5 ’ ‑GACCCARGGATACAAGGACA‑3’， H4‑R的序列信息： 5 ’ ‑AAATGCAAATCTGGCACC‑3’； 探针为H4 ‑P， 如SEQ ID NO： 3所示： H4‑P的序列信息： 5 ’ ‑TTGTGGGCTTGTC‑3’。 2.如权利 要求1所述的检测H4亚型禽流感病毒的特异性引物和探针， 其特征在于， H4 ‑P 的5’端进行报告荧 光染料Cy5标记， 3 ’端进行荧光淬灭基团MGB标记。 3.检测H4亚型禽流感病毒 的荧光定量RT ‑PCR试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权 利要求1或2所述的特异性引物和探针。 4.如权利 要求3所述的检测H4亚型禽流感病毒的荧光定量RT ‑PCR试剂盒， 其特征在于： 所述的特异性引物和探针浓度均为10微摩尔。 5.如权利 要求3所述的检测H4亚型禽流感病毒的荧光定量RT ‑PCR试剂盒， 其特征在于， 试剂盒还包括一步法荧光定量P CR反应缓冲液、 一步法荧光定量PCR反应 混合酶和无核酸酶 水。 6.如权利 要求6所述的检测H4亚型禽流感病毒的荧光定量RT ‑PCR试剂盒， 其特征在于， 试剂盒包括 10微升一步法荧光定量P CR反应缓冲液、 1微升一步法荧光定量P CR反应混合酶、 0.5微升10微摩尔的H4 ‑F、 0.5微升10微摩尔的H4 ‑R、 0.5微升10微摩尔的H4 ‑P、 2微升模板、 5.5微升无核酸酶水， 总反应 体系为20微升， 其中模板为阳性对照、 阴性对照或待检样本 。 7.如权利 要求6所述的检测H4亚型禽流感病毒的荧光定量RT ‑PCR试剂盒， 其特征在于， 试剂盒的荧光定量RT ‑PCR反应扩增条件： 第一阶段， 反转录： 55摄氏度， 15分钟； 第二阶段， 预变性： 95摄氏度， 30秒； 第三阶段， PCR扩增： 95摄氏度， 5秒； 60摄氏度， 34秒， 40个循环， 每 次循环第三阶段6 0摄氏度扩增后采集 荧光信号， 选择荧 光通道Cy5。 8.权利要求3 ‑7所述的检测H4亚型禽流感病毒的荧光定量RT ‑PCR试剂盒的使用方法， 包括如下步骤： 1)利用核酸 提取试剂从待测样本中提取RNA； 2)利用检测试剂盒中提供的引物与探针、 一步法荧光定量PCR反应缓冲液、 一步法荧光 定量PCR反应混合酶和无核酸酶水进行荧 光定量RT ‑PCR反应， 扩增核酸； 3)荧光定量RT ‑PCR反应扩增条件： 第一阶段， 反转录： 55摄氏度， 15分钟； 第二阶段， 预 变性： 95摄氏度， 30秒； 第三阶段， PCR扩增： 95摄氏度， 5秒； 60摄氏度， 34秒， 40个循环， 每 次 循环第三阶段6 0摄氏度扩增后采集 荧光信号， 选择荧 光通道Cy5； 4)根据Ct值判断荧 光定量RT ‑PCR检测结果， 判定样品中是否含有H4 亚型禽流感病毒。 9.权利要求3 ‑7所述的检测H4亚型禽流感病毒的荧光定量RT ‑PCR试剂盒用于快速鉴定 H4亚型禽流感病毒的应用。 10.如权利要求9所述的应用， 所述试剂盒用于体液、 尿囊液或其 他环境样本中的检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115125333 A 2用于检测H4亚型禽流感病毒 的特异性引物和探针及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学诊断技术领域， 涉及快速检测H4亚型禽流感病毒的荧光定 量RT‑PCR方法的引物与探针组合， 及利用该组合 来快速鉴定 H4亚型禽流感病毒的应用。 背景技术 [0002]1956年， H4亚型禽流感病毒第一次在捷克斯洛伐克的鸭子中分离出来， 随后在亚 洲、 欧洲和北美等国家的野生和家养禽类中广泛传播。 近年来， 在中国华中、 华东和华南等 地的活禽市场中发现同一宿 主共同感染H4与其他亚型禽流感病毒事件， 另外在家鸭中发现 H4亚型病毒与其他亚型禽流 感病毒(如H3亚型)之间发生了重组。 除禽类外， 哺乳动物(如海 豹和猪)中也能分离出H4亚型流感病毒。 有研究表明H4亚型禽流感病毒无需事先适应即可 在小鼠体内复制， 并可通过密切接触在豚鼠之间传播。 值得注意的是， H4N8亚型病毒(A/ slaty‑backed gull/Japan/6KS0185/2006)可以导致小鼠出现严重的呼吸道症状， 最终死 亡。 1999年， 从加拿大的猪中分离出的两株H4N6低致病性流 感病毒株， 其血凝素蛋白中出现 了Q226L和G228S氨基酸突变， 提示这两株病毒与人类受体结合的亲和力有所提高。 此外， 血 清流行病学研究表明， 经常接触活家禽的人群， 包括家禽养殖者、 工人和兽医， 感染H4亚型 禽流感病毒的风险更大。 以上研究都清楚地揭示了H4亚型禽流感病毒对公众健康构成的潜 在威胁。 [0003]目前禽流感病毒感染的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、 血清学方法和分子生物 学方法， 如逆转录酶聚合酶链反应和实时定量聚合酶链反应。 当前逆转录酶聚合酶链反应 和实时定量聚合酶链反应检测技术现在已经足够成熟， 并广泛应用于流感病毒的快速诊 断。 目前商用的流感病毒检测试剂盒主要包括用于检测病毒核蛋白抗原的酶联免疫分析 法， 以及用于检测甲型流感病毒基质基因的实时逆转录定量聚合酶链反应。 但当前并未有 快速、 有效的特异性检测 H4亚型禽流感病毒方法， 因而开发一种快速、 灵敏、 有效的H4亚型 禽流感病毒检测产品势在必行， 这能促进更早更广泛的发现H4亚型禽流感病毒感染， 控制 疫情扩散 。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一组针对H4亚型禽流感病毒血凝素基因的特异性引 物和探 针， 能特异性检测H4 亚型禽流感病毒。 [0005]本发明的第二个目的提供一种H4亚型禽流感病毒荧光定量RT ‑PCR检测试剂盒， 具 有特异性好、 灵敏度高、 准确性好、 检测速度快、 操作简 便等特点。 通过以下步骤和技术方案 实现： [0006]设计特异性引物与探针： 根据H4血凝素基因保守区域设计了一组针对H4亚型禽流 感病毒血凝素基因的检测引物与探针， 包括两条引物和一条探针， 序列分别是： [0007]上游引物： H4 ‑F： 5’ ‑GACCCARGGATACAAGGACA‑3’(SEQ ID No.1)， [0008]下游引物： H4 ‑R： 5’ ‑AAATGCAAATCTGGCACC‑3’(SEQ ID No.2)；说　明　书 1/4 页 3 CN 115125333 A 3