(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210607946.9 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 昆明理工大 学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253号 (72)发明人 刘丽　赵恒　冯悦　夏雪山　 (74)专利代理 机构 昆明同聚专利代理有限公司 53214 专利代理师 苏芸芸 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C40B 50/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于检测CHIKV、 DENV、 Z IKV分型区基因组的 引物组合及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测CHIKV、 DENV、 ZIKV分型区基因组的引物组合， 其包括用于 CHIKV、 DENV、 ZIKV  RNA逆转录的特异性引物、 扩 增分型区基因组的引物， 采用该引物组合， 利用 逆转录和多重PCR对靶基因进行扩增后， 在二代 测序平台的基础上， 构建用于检测CHIKV、 DENV、 ZIKV分型区基因组及突变位点的二代测序技术， 该方法具有 适用性广、 通量高、 准确性好、 灵敏性 高， 一次可检测出多个样本的优点， 为CHIKV、 DENV、 ZIKV基因组的深度分析提供了便捷方法， 对流行病学研究及临床早期分子诊断等具有重 要意义。 权利要求书1页 说明书15页 序列表24页 附图5页 CN 114807448 A 2022.07.29 CN 114807448 A 1.一种用 于检测CHIKV、 DENV、 ZIKV分型区基因组的引物组合， 其特征在于： 包括用 于 CHIKV、 DENV、 ZIKV  RNA逆转录的特异性引物、 扩增分型区基因 组的引物。 2.根据权利要求1所述的用于检测CHIKV、 DENV、 ZIKV分型区基因组的引物组合， 其特征 在于： 用于ZIKV  RNA逆转录的特异性引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:69  ‑ SEQ ID NO:86 所示， 用于CHIKV  RNA逆转录的特异性引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:87  ‑ SEQ ID NO:99 所示， 用于DENV  RNA逆转录的特异性引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:100‑ SEQ ID NO:151 所示。 3.根据权利要求1所述的用于检测CHIKV、 DENV、 ZIKV分型区基因组的引物组合， 其特征 在于： 扩增ZIKV分型区基因组的引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1‑ SEQ ID NO:12所示， 扩 增CHIKV分型区基因组的引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:13‑ SEQ ID NO:22所示， 扩增 DENV分型区基因 组的引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:23‑  SEQ ID NO:68所示。 4.采用权利要求1所述的用于检测CHIKV、 DENV、 ZIKV分型区基因组的引物组合检测病 毒的方法， 其特征在于： 提取样品RNA， 以提取的RNA 为模板， 采用用于病毒RNA逆转录的特异 性引物逆转录出cDNA； 然后以cDNA为模板， 采用多重PCR方法扩增靶基因； 构建靶基因文库， 对所得文库进行二代测序， 通过二代测序技 术进行突变位 点筛查和病毒分型。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807448 A 2用于检测CHIKV、 DENV、 Z IKV分型区基因组的引物组合及检测 方法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 涉及一种检测CHIKV、 DENV、 ZIKV分型区基因组的引物 组合， 利用二代测序技 术检测CHIKV、 DENV、 ZIKV分型区基因 组及突变位 点。 背景技术 [0002]虫媒病毒是指传播媒介为节肢动 物的一类病毒， 其最主要的传播媒介为蚊、 蜱、 白 蛉或蠓等， 与人类疾病相关的大部分虫媒病毒传播是靠被感染的节肢动物叮咬人体实现 的， 大部分由虫媒病毒造成的疾病均属于人畜共患病， 主要是脊椎动物感染。 临床上， 虫媒 病毒感染是急性的， 最常见的是无症状 （60 ‑80%的患者） 或引发流感样症状， 导致轻度至严 重发热， 并且根据病毒的不同， 可伴有皮疹、 结膜炎、 肌痛和 头痛， 极少数情况下， 虫媒病毒 感染会出现严重症状， 如出血热和神经系统疾病。 在某些情况下， 虫媒病毒感染后会出现持 续数周至数年的长期后遗症。 [0003]可导致人类患病的虫媒病毒有很多， 它们大多集中分布在披膜病毒科， 黄病毒科 和布尼亚病毒科， 此外， 在弹状病毒科， 正粘病毒科和呼肠孤病毒科也有分布。 基孔肯亚病 毒 （Chikungunya  virus， CHIKV） 属于披膜病毒科甲病毒属， 在系统发育上分亚洲基因型、 西 非基因型和中东南部非洲基因型； 登革病毒 （Dengue  virus， DENV） 属于黄病毒科黄病毒属， 根据系统发育分析和抗原表位分析DENV被分为四种血清型； 寨卡病毒 （Zika  virus， ZIKV） 属于黄病毒科黄病毒属， ZIKV毒株主要分为非洲谱系和亚洲谱系两大谱系。 虫媒病毒人畜 共患， 流行广， 传播快， 传播方法隐匿， 流行趋势难以预测， 临床症状相似， 区分病毒感染尤 为重要， 对常见虫媒病毒基因组的检测 不仅可以作为临床判断病毒感染的依据， 还能对病 毒样本进行流行病 学和变异位点突变等分析， 对于指导临床治疗、 虫媒疾病防控和病毒研 究具有重要意义。 目前关于虫媒病毒的研究主要集中在快速检测、 疫苗和药物 等方面。 快速 检测主要使用荧光定量PCR核酸检测和血清抗体检测的方法， 其存在用时短， 检测方便， 诊 断准确等优点。 为了更加深入的探究虫媒病毒的基因序列等特征， 目前有很多关于虫媒病 毒部分区段的一代测序的研究， 而关于虫媒病毒基因 组序列二代测序的研究较少。 [0004]目前虫媒病毒PCR基因序列的测定主要还是使用S anger技术。 S anger测序技术以 其操作简单、 测序片段长等优点被广泛应用。 但同时， Sanger法作为一代测序技术， 其通量 低、 价格高、 效率低、 依赖于电泳分离技术， 且只能检测20%~30%以上的准种， 满足不了深度 分析数据要求。 [0005]二代测序 （Next ‑generation sequencing， NGS） 是检测和发现病毒的新手段， 过去 10年间， 已经有学者运用二代测序技术对节肢动物中的病毒进行监测。 Illumina测序平 台 是目前市面上应用最广泛的二代测序平台， 因其测序错误率低， 适用于宏基因组测序和全 基因组测序， 应用领域广泛， 具有通 量高、 用时短、 经济、 灵敏性 好、 准确率高等特点。说　明　书 1/15 页 3 CN 114807448 A 3