(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210635291.6 (22)申请日 2022.06.06 (71)申请人 四川农业大 学 地址 611130 四川省成 都市温江区惠民路 211号 申请人 四川省林业科 学研究院 (72)发明人 杨汉波　辜云杰　朱艳　彭建　 谢佳鑫　安文娜　朱鹏　陈良华　 何方　 (74)专利代理 机构 四川省方圆智云知识产权代 理事务所(普通 合伙) 51368 专利代理师 王悦 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6858(2018.01) (54)发明名称 用于桢楠种质鉴定的SSR分子标记引物组合 及应用 (57)摘要 本发明公开了用于桢楠种质鉴定的SSR分子 标记引物组合， 所述SSR分子标记引物有5对， 分 别为PZmk03、 PZmf07、 PZmf05、 PZmf06和PZmf10。 本发明开发5对SSR特异性标记引物克服形态学 标记准确性低的缺点， 弥补现有的AFLP、 RAPD、 ISSR等分子标记技术缺乏特异性的缺点， 可 实现 对桢楠种质的高效、 科 学、 准确的鉴定 。 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图2页 CN 114921461 A 2022.08.19 CN 114921461 A 1.用于桢楠种质鉴定的SSR分子标记引物 组合， 其特征在于， 所述SSR分子标记引物有5 对， 分别为PZmk0 3、 PZmf07、 PZmf0 5、 PZmf06和PZmf10， 其中： PZmk03的前向引物序列如SEQ  ID No.1所示， 后向引物序列如SEQ  ID No.2所示； PZmf07的前向引物序列如SEQ  ID No.3所示， 后向引物序列如SEQ  ID No.4所示； PZmf05的前向引物序列如SEQ  ID No.5所示， 后向引物序列如SEQ  ID No.6所示； PZmf06的前向引物序列如SEQ  ID No.7所示， 后向引物序列如SEQ  ID No.8所示； PZmf10的前向引物序列如SEQ  ID No.9所示， 后向引物序列如SEQ  ID No.10所示。 2.一种用于桢楠种质鉴定的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含权利要求1所述的 SSR分子标记引物组合。 3.权利要求1所述的SSR分子标记引物 组合或权利要求2所述的试剂 盒在桢楠种质鉴定 或指纹图谱构建中的应用。 4.一种桢楠S SR指纹图谱的构建方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)提取桢楠植株的总DNA； (2)以步骤(1)的总DNA为模板， 以权利要求1所述的5对S SR分子标记引物进行PCR扩增； (3)毛细管电泳检测步骤(2)的扩增产物， 收集数据； (4)对步骤(3)的数据进行处 理， 构建出桢楠的S SR指纹图谱。 5.根据权利要求 4所述的构建方法， 其特 征在于， PCR扩增中： PCR反应体系共25uL:上下游引物各1uL， DNA模板1uL， PCR  mix 12.5uL， 9.5uL的无酶无 菌水； PCR反应程序:94℃预变性4min； 94℃变性30s， 56 ‑60℃复性30s， 72℃延伸1min， 35个循 环； 最后72℃延伸5mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921461 A 2用于桢楠种质鉴定的S SR分子标记引物组合及应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学领域， 具体涉及用于桢楠种质鉴定的SSR分子标记引物组 合及应用。 背景技术 [0002]遗传标记是基因型的特殊的易于识别的表现形式。 理想 的遗传标记应具备以下4 个条件： (1)具有较强的多态 性； (2)表现为共显性， 因而能够鉴别出纯和基因型或杂合基因 型； (3)对主要的农艺性状没有影响； (4)经济方便， 容易观察记载。 形态标记即植物的外部 特征特性， 如树高、 胸径、 叶色、 叶形等。 此种形态标记简单直观， 长期以来作为种质资源鉴 定及育种材料选择 的基本方法。 但是形态标记数少、 多态性差、 易受环境条件的影响， 容易 造成种质资源鉴定错误。 相较于形态标记， 分子标记具有以下优势： (1)直接以DNA的形式呈 现， 在植物的各组织、 各发育时期均可检测到， 不受季节、 环境限制， 不存在表达与否的问 题； (2)数量极多， 遍及整个基因组； (3)多态性高， 存在许多等位变异； (4)表现为 “中性”， 不 影响目标性状的表达， 与不良性状无必然的连锁； (5)许多标记表现为共显性， 能够鉴别出 纯和基因型和杂合基因型， 提供完整的遗传信息。 在林木基因组中存在着许多由1 ‑4个碱基 对组成的简单重复序列， 如(GA)n、 (AC)n、 (GAA)n(其中n为重复次数)等， 这些重复序列分布 遍及所有的染色体及染色体的各个区段， 称为简单重复序列(SSR)， 又称为微卫星。 SSR可直 接反映遗传信息， 并具有操作简单、 稳定性好以及通用性好等优点， 被广泛应用于品种鉴 定、 分子育种等方面。 [0003]王英等.3种楠木DNA提取及其ISSR标记鉴别.四川农业大学学报,2016,34(4): 450‑477.这篇文献从20条ISSR引物中筛选出7条引物对紫楠、 浙江楠和桢楠3种木材进行 PCR扩增， 可用于鉴别和区分3种楠属植物木材。 该方法存在以下不足： (1)所使用的引物为 ISSR引物， ISSR引物为通用引物， 即所有的植物均可以从ISSR引物库中筛选出合适的引物 序列， 特异性差； (2)ISSR为显性遗传标记， 不能区分显性纯和基因型和杂合基因型； (3)该 文筛选的ISSR引物 适用于楠木不同种间的木材鉴别， 无法对种内的个体种质资源进 行有效 区分和鉴别。 [0004]张炜.桢楠种质资源遗传多样性和水肥管理技术对幼树生长和生理特性的影响. 四川农业大学博士学位论文,2015.建立了桢楠AFLP分子标记技术体系， 选择12对AFLP分子 标记引物对桢楠种质进行遗传多样性分析， 根据条带迁移率来分析桢楠的遗传变异。 该方 法存在以下不足： (1)AFLP为光谱型的分子标记技术， 引物为通用引物， 不具有特异性； (2) AFLP分子标记 技术通过聚丙烯 酰胺凝胶电泳进 行检测， 分辨率低； (3)采用荧光标记的引物 进行荧光电泳检测， 成本高。 [0005]张炜， 龙汉利， 贾廷彬， 等.桢楠DNA提取和RAPD条件的优化.四川林业科技， 2011， 32(4)： 55 ‑62.提供了桢楠新鲜叶片、 硅胶干燥叶片材料的DNA提取方法， 并对影 响RAPD反应 的各因素进行优化， 得到了桢楠RAPD的优化反应体系及程序。 该方法存在以下不足： (1)DNA 提取方法并不十分合理， 依照文献提供的方法得到高质量DNA的几率偏低； (2)未提供相当说　明　书 1/10 页 3 CN 114921461 A 3