(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210714738.9 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 江西省农业科 学院畜牧兽医研究所 地址 330200 江西省南昌市青云谱区南 莲 路602号 (72)发明人 魏岳　张危红　谢金防　武艳平　 黄江南　唐维国　谢明贵　陈介文　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 王艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) (54)发明名称 用于扩增影 响鸡羽速性状的miRNA的特异性 引物、 其检测试剂盒和应用 (57)摘要 本发明公开了用于扩增影响鸡羽速性状的 miRNA的特异性引物、 其检测试剂盒和应用， 所述 特异性引 物序列为SEQ  ID NO.4所示。 本发明还 公开了检测试剂盒及其应用和检测方法。 本发明 首次研究获得了影响鸡羽速性状的miRNA， 本发 明提供的Novel ‑miR‑33可用于开发鸡羽速性状 的辅助选择标记， 同时用于研究miRNA在鸡羽速 性状中的调控机制及信号通路； 并且同时基于该 miRNA研究获得了检测该miRNA表达量的特异性 引物， 并研发获得了检测试剂盒。 本发明提供的 检测试剂盒可用于检测Novel ‑miR33在鸡皮肤组 织中的表达量， 筛选或选育不同羽速性状的群 体， 检测方法简单 快捷、 准确可靠 。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 114990231 A 2022.09.02 CN 114990231 A 1.用于扩增影响鸡羽速性状的miRNA的特异性引物， 其特征在于， 所述特异性引物序列 如SEQ ID NO.5所示。 2.根据权利要求1所述的影响鸡羽速性状的miRNA表达量的特异性引物， 其特征在于， 所述影响鸡羽速性状的miRNA为  Novel‑miR33， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 3.一种检测影响鸡羽速性状的miRNA的表达量的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 权利要求1所述的特异性引物和荧 光定量引物对SEQ  ID NO.6和SEQ  ID NO.7所示。 4.根据权利要求  3所述的检测影响鸡羽速性状的miRNA的表达量的试剂盒， 其特征在 于， 所述检测试剂盒还包括2 ×RT EasyTM Mix、 2×EasyTM Mix‑SYBR、 内参基因引物和 Rnase‑FreeddH2O。 5.根据权利要求  3所述的检测影响鸡羽速性状的miRNA的表达量的试剂盒， 其特征在 于， 所述内参基因引物包括内参基因反转录引物SEQ  ID NO.8和内参基因荧光定量引物对 SEQ ID NO.9和SEQ  ID NO.10所示。 6.权利要求1所述的特异性引物或权利要求2~5任一项所述的试剂盒在鸡羽速性状鉴 定、 筛选或选育不同羽速性状的群 体中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述应用为通过反转录和荧光定量PCR检 测翅尖皮肤组织中miRNA的表达量来判断鸡羽速类型， 所述影响鸡羽速性状的miRNA为   Novel‑miR33， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 8.权利要求3~5任一项所述试剂盒的检测方法， 其特征在于， 具体方法为通过反转录和 荧光定量P CR检测所述的mi RNA在翅尖皮肤组织的表达量判断鸡羽毛发育快慢， 所述影响鸡 羽速性状的miRNA为  Novel‑miR33， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990231 A 2用于扩增影响鸡羽速性状的miRNA的特异性引物、 其检测试剂 盒和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物工程领域， 具体涉及用于扩增影响鸡羽速性状的miRNA的的特异 性引物、 其检测试剂盒和应用。 背景技术 [0002]羽毛属于家禽的表皮附属物， 雏鸡出壳时， 根据主翼羽与覆主翼羽的长短差异， 可 以区分为快羽和慢羽。 研究发现， 雏鸡羽毛生长速度的差异是由于位于性 染色体Z上的一对 等位基因决定的， 其中慢羽相对于快羽表现为显性， 用K表示。 利用鸡羽速性状伴性遗传特 点， 建立的自别雌雄技术， 具有快速简便、 减少应激和疾病传播等优点， 已在生产中得到广 泛应用， 国内外许多品种都采用羽速差别建立了自别雌雄配套系， 如国外的海兰、 罗曼蛋 鸡、 贵妃鸡等， 我国的杏花鸡、 狼山鸡、 清远麻鸡等(宋素芳， 康相涛， 竹学军.羽速基因在养 鸡业中的应用[J].中国家禽， 2003， 25(18)： 33 ‑36.)。 然而， 通过单一表型鉴定区分快羽和 慢羽有时会出现判断不准(如不同羽翼间差距较小造成判断模糊)等情况， 最 终造成表型与 实际基因型不符的问题， 影响生产应用中的可靠性。 因而， 利用分子标记筛选， 提高表型选 择的可靠性， 对于加快育种进度和选种的准确 性具有重要意义。 早期研究发现， K基因与禽 白血病内源性病毒ev21(endogenous  virus 21)插入片段存在紧密连锁的关系， 因而常常 被作为区分快慢羽类型 的一个重要的分子标记来使用(韩瑾润.影响羽毛发育的生长因子 及相关ev21调控的研究[D].北京： 中国农业大学， 2007.)(初芹， 张剑， 张爱平， 等.北京油鸡 羽速基因分子检测及其对生产性能的影响[J].中国家禽， 2011， 33(6)： 30 ‑33.)。 然而， ev21 的整合不是造成慢羽的直接原因， 同时由于ev21属于是E亚型内源性白血病病毒家族成员 之一， 可以编 码出可感染性的病毒序列， 还可以弥补其它缺陷型病毒 形成完整的病毒， 也能 与其它evs互作， 调节其它前病毒的表达水平(Smith  E.J.， Fadly  A.M..Influence  of  congenital  transmission  of endogenous  virus 21 on the immune response  to  avian leucosis  virus infection  and the incidence  of tumors in chickens[J] .Poultry Science， 1988， 67(12)： 1674 ‑1679.)。 即使ev2 1的表达不直接引发鸡的白血病， 但是也在一定程度上抑制鸡的免疫力， 使鸡 处于长期带毒状态从而影响多个生产性状， 对 鸡群的健康存在潜在的威胁(Fadly  A.M.， Smith E.J.Influence  of maternal  antibody   on avian leukosis  virus infection  in white leghom chickens  harboring   endogenous  virus‑21(EV21)[J].Avian  Diseases， 1991， 35(3)： 443 ‑451.)(Fadly A.M.， Smith E.J.Role  of contact and genetic transmission  of endogenous  virus‑21 in  the susceptibility  of chickens  to avian leukosis  virus infection  and tumors [J].Poultry  Science， 1997， 76(7)： 968 ‑973.)。 另外， 通过对羽速基因K/k位点 的研究发 现， K基因上存在的串 联重复， 使泌乳刺激素受体(PRLR)基因和编码精子鞭毛蛋白2(SPEF2) 的基因发生了部分重复， 进而将PRLR基因、 SPEF2基因和融合基因dPRLR/dSPEF2作为羽速的 候选基因(Elferink  M.G.， Vall ée A.A.， Jungerius  A.P.， et al.Partial  duplication  说　明　书 1/5 页 3 CN 114990231 A 3