(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210631750.3 (22)申请日 2022.06.06 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114703288 A (43)申请公布日 2022.07.05 (73)专利权人 珠海圣美生物诊断技 术有限公司 地址 519000 广东省珠海市香洲区同昌路 266号3栋3层 (72)发明人 齐盼盼　唐东江　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 宋南 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 114277142 A,202 2.04.05 审查员 徐丹 (54)发明名称 用于扩增EGFR-T790M基因变异的blocker 探 针、 引物组及其应用 (57)摘要 本发明涉及基因检测技术领域， 尤其是涉及 用于扩增EGFR ‑T790M基因变异的blocker探针、 引物组及其应用。 本发明提供的blocker探针长 度小于20nts， 同时突变位点两侧1或2nts范围内 的锁核酸修饰又能够保证其与野生型模板结合 的热稳定性。 此外， 本发明还提供了用于扩增 EGFR‑T790M基因变异的引物组， 该引物组包含上 述blocker 探针， 同时还包 括与该blocker 探针搭 配使用的两条上游引物， 两条上游引物的设置能 够避免SNP位点rs1050171存在G＞A突变时， 假阴 性结果的出现。 权利要求书1页 说明书14页 序列表6页 附图6页 CN 114703288 B 2022.09.13 CN 114703288 B 1.用于扩增EGFR ‑T790M基因变异的blocker探针， 其特征在于， 所述blocker探针的核 苷酸序列选自SEQ  ID No.1~4中任一种， SEQ  ID No.1所示核苷酸序列为CTCATCA CGCAGCTC， SEQ ID No.2所示核苷酸序列为CTCATCA CGCAGCTC， SEQ  ID No.3所示核苷酸序列为 CTCATCACGCAGCTCATG， SEQ  ID No.4所示核苷酸序列为CTCATCA CGCAGCTCATGC； 所述blocker 探针的3’端经过延伸阻断修饰， 所述blocker探针中斜体并字体加粗标出的核苷酸对应突 变位点， 下划线表示该核苷酸经 过锁核酸 修饰。 2.用于扩增EGFR ‑T790M基因变异的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括权利 要求1所 述的blocker探针、 两条 上游引物和至少一条 下游引物； 所述两条上游引物的核苷酸序列均覆盖EGFR ‑T790M基因前的SNP位点rs1050171， 其中 第一上游引物的核苷酸序列为Xm1AXn1， 所述Xm1为rs1050171位点上游m1个与EGFR ‑T790M基 因片段匹配核苷酸， 所述Xn1为rs1050171位点 下游n1个与EGFR ‑T790M基因片段匹配核苷酸， 第二上游引物的核苷酸序列为Xm2GXn2， 所述Xm2为rs1050171位点上游m2个与EGFR ‑T790M基 因片段匹配核苷酸， 所述Xn2为rs1050171位点 下游n2个与EGFR ‑T790M基因片段匹配核苷酸， 所述n1和n2均选自3~7中任意数值； 所述两条上游引物的3 ’端与blocker探针的5 ’端存在核苷酸重叠， 重叠的核苷酸数量 为1~7。 3.根据权利要求2所述的引物组， 其特征在于， 所述引物组还包括荧光探针， 所述荧光 探针结合EGFR ‑T790M基因的反义链。 4.权利要求1所述bl ocker探针或权利要求2或3所述引物组的用途， 所述用途 包括： （1） 制备选择性扩增EGFR ‑T790M基因突变型的制剂、 PCR反应 体系或试剂盒； 或者， （2） EGFR ‑T790M基因突变型检测前扩增富 集； 或者， （3） EGFR ‑T790M基因突变型检测前建库。 5.非诊断目的的EGFR ‑T790M基因突变型选择性扩增方法， 其特征在于， 使用权利要求1 所述blocker探针或权利要求2或3所述引物组配置PCR反应体系， 待扩增样本经变性、 退火 和延伸后， 分析扩增产物； 所述退火温度和延伸温度相同， 选自54~62℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703288 B 2用于扩增EGFR ‑T790M基因变异的bl ocker探针、 引物组及其 应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因检测技术领域， 尤其是涉及用于扩增EGFR ‑T790M基因变异的 blocker探针、 引物组及其应用。 背景技术 [0002]目前在qPCR平台上 ， 对肿瘤突变位点检测常 用方法为突变扩增系统 (amplification  refractory  mutation  system, ARMS)法， 本方法的上游引物和blocker 为竞争性结合关系， 利用引物/blocker与模板间的Tm值差使blocker和野生型模板优先结 合， 引物优先与突变型结合， 阻断野生型扩增， 不阻断突变型扩增， 从而达到富集突变型模 板的效果。 [0003]基于此， 申请人于2019年5月21日提交中国专利局、 申请号为CN2019104222174、 发 明名称为“一种用于扩增变异型靶基因片段 的非淬灭型寡核苷酸探针及其应用 ”的中国发 明专利申请以及其多件同族发明申请中提供了用于EGFR ‑T790M基因突变型选择性扩增的 blocker探针。 [0004]然而， 在后续使用过程中， 申请人发现， （1） 由于上述blocker探针过长， 使得其在 qPCR反应体系中表现较差， 对突变型也有明显抑制， 无法达到较好效果； （2） T790M位点前存 在高频SNP位点rs1050171 （G>A） ， 在19.6%的亚洲人中， rs105017 1位点是A （G>A） ， rs105017 1 的突变状态会影 响基于ARMS的EGFR ‑T790M检测系统的灵敏度， 从而产生假阴性 或假阳性的 结果。 [0005]鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0006]本发明的目的在 于， 在申请人现有EGFR ‑T790M基因变异的blocker探针基础上， 对 blocker探针进一步改进， 得到迭代的blocker探针和 扩增引物组， 以进一步提高低频率基 因变异的检测灵敏， 同时期 望该blocker探针能够在qPCR条件 下取得不逊于数字PCR或高通 量测序的检测效果， 从而取 得操作简单、 成本低、 性 价比高的优势。 [0007]为了解决上述 技术问题， 实现上述目的， 本发明提供以下技 术方案： [0008]第一方面， 本发明提供用于扩增EGFR ‑T790M基因变异的blocker探针， （1） 所述 blocker探针的核苷酸序列覆盖EGFR ‑T790M基因突变位点， 与野生型EGFR ‑T790M基因片段 完全匹配， 与突变型EGFR ‑T790M基因片段在突变位点错配； （2） 所述b locker探针核苷酸序 列长度小于20nts， 其中突变位 点及两侧1或2nts范围内对应碱基经 过锁核酸 修饰。 [0009]在可选的实施方式中， 所述blocker探针的核苷酸序列从5 ’端到3’端为 （Xm） CACGC （Xn） 或与其严格杂交的互补序列， 所述Xm为突变位点上游m个与野生 型EGFR‑T790M基因片段 完全匹配核苷酸， 所述Xn为突变位点下游n个与野生型EGFR ‑T790M基因片段完全匹配核苷 酸， 所述m+n＜15， 所述blocker探针中斜体并字体加粗标出的核苷酸对应突变位点， 下划线说　明　书 1/14 页 3 CN 114703288 B 3