(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210632956.8 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 青岛啤酒股份有限公司 地址 266023 山东省青岛市 市北区登州路 56号 (72)发明人 尹花　贺扬　董建军　胡淑敏　 万秀娟　赵玉祥　侯晓平　陈嵘　 (74)专利代理 机构 青岛清泰联信知识产权代理 有限公司 3725 6 专利代理师 张洁 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/85(2006.01) (54)发明名称 用于快速检测工业巴氏酵母氮代谢转运通 透酶基因表达的引物组及检测方法 (57)摘要 本发明提出一种用于快速检测工业巴氏酵 母氮代谢转运通透酶基因表达的引物组及检测 方法， 属于生物工程领域， 能够解决常规的基因 定量检测方法存在检测通量不高、 检测 效率低、 耗时较长等的技术问题。 该检测方法案包括总 RNA的提取、 逆转录反应制 备cDNA模板、 多重PCR 反应、 毛细血管电泳、 产物片段分析， 其中， 针对 工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因为包含 Bap2‑sc， Bap2‑sb， Bap3‑sc， Bap3‑sb， Gnp1‑sc， Gnp1‑sb， Agp1‑sc， Agp1‑sb， Tat1‑sc等在内的30 个相关基因。 本发明的检测方法具有高通量、 操 作便捷、 准确性高等特点， 能够应用于工业巴氏 酵母生物工程领域。 权利要求书3页 说明书12页 序列表11页 附图6页 CN 115074458 A 2022.09.20 CN 115074458 A 1.用于快速检测工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因表达的多重PCR反应引物组， 其 特征在于， 所述引物组针对工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因Bap2 ‑sc， Bap2‑sb， Bap3‑ sc， Bap3‑sb， Gnp1‑sc， Gnp1‑sb， Agp1‑sc， Agp1‑sb， Tat1‑sc， Tat1‑sb， Tat2‑sc， Tat2‑sb， Dip5‑sc， Mup1‑sc， Mup1‑sb， Hip1‑sc， Hip1‑sb， Lyp1‑sc， Lyp1‑sb， Alp1‑sc， Alp1‑sb， Gap1‑ sc， Gap1‑sb， Put4‑sc， ， Mep1 ‑sc， Mep1‑sb， Mep2‑sc， Mep2‑sb， Mep3‑sc， Mep3‑sb设计得到30 条引物， 分别如SEQ  ID NO.1、 SEQ  ID NO.3、 SEQ  ID NO.5、 SEQ  ID NO.7、 SEQ  ID NO.9、 SEQ   ID NO.11、 SEQ  ID NO.13、 SEQ  ID NO.15、 SEQ  ID NO.17、 SEQ  ID NO.19、 SEQ  ID NO.21、 SEQ   ID NO.23、 SEQ  ID NO.25、 SEQ  ID NO.27、 SEQ  ID NO.29、 SEQ  ID NO.31、 SEQ  ID NO.33、 SEQ   ID NO.35、 SEQ  ID NO.37、 SEQ  ID NO.39、 SEQ  ID NO.41、 SEQ  ID NO.43、 SEQ  ID NO.45、 SEQ   ID NO.47、 SEQ  ID NO.49、 SEQ  ID NO.51、 SEQ  ID NO.53、 SEQ  ID NO.55、 SEQ  ID NO.57以及 SEQ ID NO.59所示。 2.用于快速检测工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因表达的逆转录反应引物组， 其特 征在于， 所述引物组针对工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因Bap2 ‑sc， Bap2‑sb， Bap3‑sc， Bap3‑sb， Gnp1‑sc， Gnp1‑sb， Agp1‑sc， Agp1‑sb， Tat1‑sc， Tat1‑sb， Tat2‑sc， Tat2‑sb， Dip5‑ sc， Mup1‑sc， Mup1‑sb， Hip1‑sc， Hip1‑sb， Lyp1‑sc， Lyp1‑sb， Alp1‑sc， Alp1‑sb， Gap1‑sc， Gap1‑sb， Put4‑sc， Mep1‑sc， Mep1‑sb， Mep2‑sc， Mep2‑sb， Mep3‑sc， Mep3‑sb设计得到30条引 物， 分别如SEQ  ID NO.2、 SEQ  ID NO.4、 SEQ  ID NO.6、 SEQ  ID NO.8、 SEQ  ID NO.10、 SEQ  ID  NO.12、 SEQ  ID NO.14、 SEQ  ID NO.16、 SEQ  ID NO.18、 SEQ  ID NO.20、 SEQ  ID NO.22、 SEQ  ID  NO.24、 SEQ  ID NO.26、 SEQ  ID NO.28、 SEQ  ID NO.30、 SEQ  ID NO.32、 SEQ  ID NO.34、 SEQ  ID  NO.36、 SEQ  ID NO.38、 SEQ  ID NO.40、 SEQ  ID NO.42、 SEQ  ID NO.44、 SEQ  ID NO.46、 SEQ  ID  NO.48、 SEQ  ID NO.50、 SEQ  ID NO.52、 SEQ  ID NO.54、 SEQ  ID NO.56、 SEQ  ID NO.58以及SEQ   ID NO.60所示。 3.快速检测工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因表达的方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： 在NCBI数据库 中查找酿酒酵母的氮代谢相关基因， 通过BLASTn序列比对， 锁定工业巴 氏酵母T1 ‑1基因组中的同源基因序列信息， 即工业巴氏酵母氮 代谢转运通透酶基因； 根据所述 同源基因序列信息， 分别对 ‑Sc和‑Sb来源的同一基因进行CLUSTAL  W比对寻 找非同源区段进行引物设计， 得到如权利要求2所述的逆转录反应引物组以及如权利要求 1 所述的多重PCR反应引物组； 工业巴氏酵母总RNA提取； 以提取得到的总RNA作为模板， 所述逆转录反应引物组作为引物进行逆转录反应制备 cDNA模板； 以逆转录反应产物作为模板， 所述多重PCR反应引物组作为引物进行多重PCR反应， 并 对多重PRC反应产物进行电泳及片段分析。 4.根据权利要求3所述的快速检测工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因表达的方法， 其特征在于， 所述氮代谢相关基因包括参与氨基酸代谢调控基因、 氮源代谢中NCR途径、 SPS 感应系统及TOR信号传导途径以及参与氮源转 运的通透酶基因。 5.根据权利要求3所述的快速检测工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因表达的方法， 其特征在于， 所述工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因为包含Bap2 ‑sc， Bap2‑sb， Bap3‑sc，权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115074458 A 2Bap3‑sb， Gnp1‑sc， Gnp1‑sb， Agp1‑sc， Agp1‑sb， Tat1‑sc， Tat1‑sb， Tat2‑sc， Tat2‑sb， Dip5‑ sc， Mup1‑sc， Mup1‑sb， Hip1‑sc， Hip1‑sb， Lyp1‑sc， Lyp1‑sb， Alp1‑sc， Alp1‑sb， Gap1‑sc， Gap1‑sb， Put4‑sc， Mep1‑sc， Mep1‑sb， Mep2‑sc， Mep2‑sb， Mep3‑sc以及Mep3 ‑sb在内的30个 基因。 6.根据权利要求3所述的快速检测工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因表达的方法， 其特征在于， 还包括作为内参基因的工业巴氏酵母β ‑actin基因ACT1 ‑Sc、 ACT1‑Sb， 逆转录 反应制备cDNA模板中内参基因引物如SEQ  ID NO.62、 SEQ  ID NO.64所示； 多重PCR反应中内 参基因引物如SEQ  ID NO.61、 SEQ  ID NO.63所示。 7.根据权利要求3所述的快速检测工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因表达的方法， 其特征在于， 所述多重PCR反应的反应体系中， 总反应体系为20 μL， 其中， 25mM  MgCl2 4.0 μ L、 5×PCR缓冲液4.0 μL、 DNA聚合酶0.7 μL、 多重PCR反应引物组2 μL、 cDNA模板9.3 μL； 反应条件为： S1、 95℃预变性10分钟； S2、 94℃变性3 0秒； 退火温度5 5℃， 30秒； S3、 68‑70℃延伸1分钟， 循环3 5次； S4、 4℃保存， 其中， S2和S3步骤 共计35个循环。 8.根据权利要求6所述的快速检测工业巴氏酵母氮代谢转运通透酶基因表达的方法， 其特征在于， 所述逆转录反应引物组中SEQ  ID NO.2的使用浓度为500nM、 SEQ  ID NO.4的使 用浓度为500nM、 SEQ  ID NO.6的使用浓度为500nM、 SEQ  ID NO.8的使用浓度为500nM、 SEQ   ID NO.10的使用浓度为15.625nM、 SEQ  ID NO.12的使用浓度为12 5nM、 SEQ ID NO.14的使用 浓度为500nM、 SEQ  ID NO.16的使用浓度为15.625nM、 SEQ  ID NO