(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210823399.8 (22)申请日 2022.07.14 (71)申请人 湛江海关技 术中心 地址 524000 广东省湛江市人民大道中47 号 (72)发明人 李家侨　谢艳辉　张娜　李献锋　 刘荭　郑晓聪　唐媛媛　刘骁　 斯泽恩　郑舒尹　 (74)专利代理 机构 北京市广友专利事务所有限 责任公司 1 1237 专利代理师 张仲波 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/63(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 用于对虾急性肝胰腺坏死病和肝肠胞虫的 检测的引物探 针组合、 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明提供了一种用于检测对虾急性肝胰 腺坏死病和肝肠胞虫的引物探针组合， 其包含： 针对急性肝胰腺坏死病特征序列的第一引物组； 针对肝肠胞虫特征序列的第二引物组； 所述急性 肝胰腺坏死病特征序列为pirAVP基因序列； 所述 肝肠胞虫特征序列为肝肠胞虫的SWP1基因序列。 本发明还提供了其在检测对虾急性肝胰腺坏死 病和肝肠胞虫感染中的应用， 以及检测试剂盒。 本发明提供的引物探针组合和试剂盒不仅可以 检测急性肝胰腺坏死病， 还可以用于肝肠胞虫， 或者同时检测上述两种疾病， 特异性强、 灵敏度 高。 权利要求书1页 说明书5页 附图5页 CN 115044691 A 2022.09.13 CN 115044691 A 1.一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病和肝肠胞虫的引物探针组合， 其特征在于， 包 含： 针对急性 肝胰腺坏死病特 征序列的第一引物组； 针对肝肠胞 虫特征序列的第二引物组； 所述急性 肝胰腺坏死病特 征序列为pir AVP基因序列； 所述肝肠胞虫特征序列为 肝肠胞虫的SWP1基因序列。 2.如权利要求1所述的引物组合， 其特 征在于， 所述pir AVP基因序列为SEQ  ID NO:7。 3.如权利要求1所述的引物组合， 其特 征在于， 所述SWP1基因序列为SEQ  ID NO:8。 4.如权利要求1所述的引物组合， 其特征在于， 所述第一引物组由SEQ  ID NO:1、 SEQ  ID  NO:2和SEQ  ID NO:3组成。 5.如权利要求1所述的引物组合， 其特征在于， 所述第二引物组由SEQ  ID NO:4、 SEQ  ID  NO:5和SEQ  ID NO:6组成。 6.如权利要求1所述的引物组合， 其特 征在于， 由第一引物对和第二引物对组成， 其中， 所述第一引物组由SEQ  ID NO:1、 SEQ ID NO:2和SEQ  ID NO:3组成； 所述第二引物组由SEQ  ID NO:4、 SEQ ID NO:5和SEQ  ID NO:6组成。 7.如权利要求6所述的引物组合， 其特征在于， SEQ  ID NO:1、 SEQ  ID NO:2、 SEQ  ID NO: 3、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6摩尔比为1:1:2:1:1:2。 8.如权利要求1 ‑7所述的引物组合在制备用于检测对虾急性肝胰腺坏死病和肝肠胞虫 感染的试剂中的应用； 优选地， 所述检测是通过荧 光定量PCR 实现的。 9.一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病或/和肝肠胞虫感染的试剂 盒， 其特征在于， 包 含如权利要求1 ‑7中任一项所述的引物组合。 10.如权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 还包含对虾急性肝胰腺坏死病阳性对照 品和肝肠胞 虫阳性对照品； 所述对虾急性肝胰腺坏死病阳性对照品为包含pirAVP基因序列的第一阳性质粒， 优选 为包含SEQ ID NO:7的质粒， 更优选为是通过将SEQ  ID NO:7插入到pUC57质粒中获得的； 所述肝肠胞虫阳性对照品为包含SWP1基因序列的第二阳性质 粒， 优选为包含SEQ  ID  NO:8的质粒； 更优为是通过将SEQ  ID NO:8插入到pUC57质粒中获得的。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044691 A 2用于对虾急性肝胰 腺坏死病和肝肠胞虫的检测的引物探针组 合、 试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及基 因检测技术领域， 具体涉及用于对虾急性肝胰腺坏死病和肝肠胞虫 的双重荧 光PCR检测的引物探针组合及试剂盒。 背景技术 [0002]急性肝胰腺坏死病(Acute  hepatopannecr osis disease,AHPND)是由副溶血性弧 菌携带的质粒编码PirAVP和PirBVP毒素基因引起的一种对虾疾病。 由于该疫病在早期(投苗 30d左右)会引起虾苗不寻常 的高死亡率而被称之为早死综合征(EMS)， 该病在全球虾类主 要养殖地区肆虐， 给越南、 中 国、 马来西亚、 泰国、 墨西哥和菲律宾等国对虾产业带来巨大损 失。 患病对虾主要临床症状表现为肝胰腺萎缩、 颜色变浅， 空肠空胃， 甲壳变软， 失去活力 等， 常为急性死 亡， 死亡率高达10 0％。 [0003]虾肝肠胞虫(Enter ocytozoon hepatopenaei,EHP)于2009 年在泰国养殖的生长缓 慢的斑节对虾中首次被分离和命名， 属于微孢子虫科、 肠胞虫属。 EHP主要寄生于对虾肝胰 腺小管的上皮细胞内， 已被证实与对虾生长缓慢关系密切。 EHP流行已经对印度、 泰国、 中 国、 越南、 马来西亚、 印度尼西亚 等亚洲各国的养殖虾业造成了严重的经济损失。 [0004]我国水产养殖规模在不断扩大， 集约化养殖模式快速发展， 水产养殖病害形势变 的非常严 峻， AHPND和EHP是当前对虾养殖主要病害， 但目前尚缺少能够快速有效的检测方 法。 发明内容 [0005]本发明提供了一种同时鉴定AHPND和EHP双 重荧光PCR方法， 适用于养殖场监控、 海 关、 水产技术推广站等部门， 对EHP和AHPND病原的检测、 分离和鉴定分析， 用于解决对虾养 殖中EHP和AHPND流行、 传播、 预防和控制的问题。 [0006]本发明首先提供了一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病和肝肠胞虫的引物探针 组合， 其包 含： [0007]针对急性 肝胰腺坏死病特 征序列的第一引物组； [0008]针对肝肠胞 虫特征序列的第二引物组； [0009]所述急性 肝胰腺坏死病特 征序列为pir AVP基因序列； [0010]所述肝肠胞虫特征序列为 肝肠胞虫的SWP1基因序列。 [0011]在根据本发明的一个实施方案中， 所述pir AVP基因序列为SEQ  ID NO:7。 [0012]在根据本发明的一个实施方案中， 所述SWP1基因序列为SEQ  ID NO:8。 [0013]在根据本发明的一个实施方案中， 所述第一引物组由SEQ  ID NO:1、 SEQ  ID NO:2 和SEQ ID NO:3组成。 [0014]在根据本发明的一个实施方案中， 所述第二引物组由SEQ  ID NO:4、 SEQ  ID NO:5 和SEQ ID NO:6组成。说　明　书 1/5 页 3 CN 115044691 A 3