(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210685434.4 (22)申请日 2022.06.15 (71)申请人 杭州瑞普基因科技有限公司 地址 311100 浙江省杭州市余杭区五常街 道联创街18 8号贝达梦工场D座7-10层 (72)发明人 王涛　胡娟　马亚茹　 (74)专利代理 机构 北京清亦华知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11201 专利代理师 赵静 (51)Int.Cl. C40B 50/06(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6874(2018.01) (54)发明名称 用于低血浆起始量、 低频突变检测的方法、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明提出用于低血浆起始量、 低频突变检 测的方法、 试剂盒及其应用， 其中， 包括一种高通 量测序文库的构建方法： 1)对提取后cfDNA进行 末端修复； 2)对末端修复产物进行接头连接； 3) 对接头连接产物进行第一次磁珠纯化； 4)对第一 纯化产物进行扩增得到扩增产物； 5)对扩增产物 进行第二次磁珠纯化得到预文库； 6)利用所述单 个预文库进行混合处理； 7)利用步骤6)获得的混 合预文库配置杂交反应体系， 并进行杂交处理； 8)将步骤7)获得的杂交产物进行特异性捕获， 以 便获得捕获文库； 9)将所述捕获文库进行扩增及 第三次磁珠纯化处理， 得到包含 所述样品基因组 DNA中突变频率不低于0.3％的DNA片段的所述高 通量测序文库。 权利要求书2页 说明书27页 附图1页 CN 115110154 A 2022.09.27 CN 115110154 A 1.一种高通量测序文库的构 建方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 利用cfDNA构建PCR扩 增体系， 进行PCR扩增处理， 以获得PCR扩增 文库， 其中， 基于50 μL所述PCR扩增体系， 标签引 物的用量为1 ‑3 μL， 扩增引物1的用量为1 ‑3 μL， PCR酶的用量为23 ‑27 μL， 所述纯化后的cfDNA 用量为18‑24 μL。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增处理的条件依次为： 98℃， 2 ‑ 4min； (98℃， 15 ‑25s， 58℃ ‑63℃， 28‑32s， 67℃ ‑78℃， 25‑35s， 2‑4步骤循环8次)； 72℃， 5min； 4℃， 保存； 任选的， 所述cfDNA预 先进行第一磁珠 纯化处理； 任选的， 将所述cfDNA使用0.8 ×的磁珠进行第一磁珠 纯化处理； 任选的， 所述cfDNA来自于待测样品； 任选的， 所述待测样品中获取的所述cfDNA的含量 为15‑30ng； 任选的， 所述待测样品包括血浆。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 进行所述第 一磁珠纯化处理时， 所述待 测样品中获取的cfDNA预 先依次进行末端修复处 理、 接头连接处 理。 4.根据权利 要求1‑3任一项所述的方法， 其特征在于， 基于50 μL所述末端修复处理的体 系， 末端修复酶的用量 为3‑8 μL， 末端修复缓冲液的用量 为8‑12 μL； 任选地， 所述末端修复处理的条件依次为： 18℃ ‑23℃， 27 ‑33min； 62℃ ‑68℃； 28 ‑ 33min。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的方法， 其特征在于， 基于100μL所述接头连接处理的 体系， 末端修复产物45 ‑55 μL， 接头用量为2.5 ‑7.5 μL， 连接酶的用量为8 ‑13 μL， 连接缓冲液 的用量为18‑22 μL。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 进一步包括： 将所述PCR扩增文库进行第二 磁珠纯化处理， 以获得DNA预测序文库； 任选地， 将所述PCR扩增文库使用1 ×的磁珠进行第二磁珠 纯化处理。 7.根据权利要求1 ‑6任一项所述的方法， 其特 征在于， 进一 步包括： 1)对多个单独的所述DNA预测序文库进行混合处 理； 2)利用步骤1)获得的产物配置杂交反应 体系， 并进行杂交 处理； 3)将步骤2)获得的杂交产物进行链亲和素磁珠捕获处 理， 以便获得捕获产物； 4)将所述捕获产物进行扩增及第三磁珠纯化处理， 以便得到所述高通量测序文库， 其 中， 所述高通 量测序文库中包括在所述样品的cfDNA中突变频率 不低于0.3％的DNA片段。 8.根据权利要求7所述的方法， 所述高通量测序文库中每个样品的文库的平均测序深 度为18000‑25000； 任选地， 所述 突变包括 点突变、 插入、 缺失； 任选地， 所述多个样品单独的DNA测序文库包括 不同的标签引物； 优选的， 所述样品的DNA测序文库的数量 不超过4个。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 基于30μL的所述杂交反应体系， 待杂交模 板1‑3 μg， 阻断剂1用量为3 ‑7μL， 杂交探针的用量为1 ‑3 μL， 阻断剂2稀释液的用量为1 ‑3 μL， 杂交缓冲液的用量 为5‑7 μL。 10.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 所述杂交处理的条件依次为： 95℃， 5min，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115110154 A 265℃， 10mi n， 65℃， 1min； (65℃， 1min； 37℃， 3s， 循环6 0次)， 65℃， 保存。 11.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述链亲和素磁珠预先用结合缓冲液进 行洗涤； 任选的， 捕获20 ‑40min后用洗涤缓冲液进行清洗 。 12.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 基于50 μL的所述捕获扩增体系， 捕获产物 的用量为22‑27 μL， 捕获扩增引物的用量 为3‑8 μL， PCR酶反应液2的用量 为22‑27 μL。 13.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述捕获后扩增的条件依次为： 98℃， 2 ‑ 4min； (98℃， 15 ‑25s， 58℃ ‑63℃， 28‑32s， 67℃ ‑78℃， 25‑35s， 2‑4步骤循环14次)； 72℃， 5min， 4℃， 保存。 14.一种高通量测序文库， 其特征在于， 是根据权利要求1 ‑13任一项所述的方法构建 的。 15.一种检测低频DNA突变的方法， 其特 征在于， 包括： 1)利用权利要求1 ‑13任一项所述的方法构建高通 量测序文库； 2)将所述高通 量测序文库上机测序， 以获得低频突变的DNA位 点； 任选地， 所述 高通量测序文库中包括在所述样品的基因组DNA中突变频率不低于0.3 ％ 的DNA片段。 16.一种试剂盒， 其特征在于， 包括下列中的至少之一： 探针、 引物、 DNA提取试剂、 核酸 纯化试剂、 末端修复酶、 末端修复缓冲液、 接头、 连接酶、 连接缓冲液、 P CR反应液、 阻断剂、 杂 交缓冲液、 结合缓冲液和洗涤缓冲液； 任选地， 所述核酸纯化试剂包括纯化磁珠。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115110154 A 3