(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210759646.2 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路15 5号 (72)发明人 卢盼　逄波　李臻鹏　李哲　阚飙　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 商秀玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (54)发明名称 用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定 的试剂盒和方法 (57)摘要 本发明涉及微生物检测技术领域， 具体涉及 用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试 剂盒和方法。 本发明提供的用于产毒型霍乱弧菌 血清群O1和O139鉴定的试剂盒包含引物组、 crRNA、 CRISPR ‑Cas蛋白和ssDNA报告分子。 该试 剂盒可实现霍乱毒素和O1/O139血清 群的快速 可 视化检测和鉴别， 具有灵敏度高， 特异性强的优 点， 能够有效缩短检测周期， 操作 简单， 不需要昂 贵的大型仪器， 且减少了样本运输过程中可能发 生的泄露或污染， 适用于霍乱弧菌的现场检测和 水体等环境 监测。 权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图6页 CN 115125315 A 2022.09.30 CN 115125315 A 1.用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含 引物组、 crRNA、 CRIS PR‑Cas蛋白和s sDNA报告分子； 所述引物组包含三个引物对， 分别针对以下靶基因： 霍乱弧菌ctxA基因、 O1群霍乱弧菌 O抗原编码决定 簇特异基因和O139群霍乱弧菌O抗原编码决定 簇特异基因； 所述crRNA包括 三个crRNA， 分别针对所述 三个引物对 扩增得到的DNA片段中的靶序列； 所述CRIS PR‑Cas蛋白具有切割s sDNA的活性。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述引物对 的核苷酸序列如下： SEQ  ID  NO.1‑2、 SEQ ID NO.3‑4和SEQ ID NO.5‑6。 3.根据权利要求1或2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.7‑9所示。 4.根据权利 要求1或2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述ssDNA报告分子的核苷酸序列 为 TTATT。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述ssDNA报告分子的5 ’端标记荧光基 团， 3’端标记猝灭基团， 或者， 所述s sDNA报告分子的5 ’端标记荧 光基团， 3 ’端标记生物素。 6.根据权利要求1～5任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas蛋白为Cas12 蛋白； 优选为Cas12a 蛋白。 7.根据权利要求1～6任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括选自 CRISPR反应缓冲液、 重组酶介导的等温扩增反应缓冲液、 重组酶、 单链结合蛋白、 DNA聚合 酶、 醋酸镁和水中的一种或多种； 优选地， 所述CRISPR反应缓冲液包括如下组分： 8 ‑12mM Tris‑HCl， 9‑12mM MgCl2， pH  7.8‑8.0。 8.权利要求1～7任一项所述的试剂盒在产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139的鉴定中的 应用。 9.一种鉴定产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139的方法， 其特征在于， 采用权利要求1～7 任一项所述的试剂盒进行产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139的鉴定， 所述方法包括如下步 骤： (1)以样品DNA为模板， 采用所述引物组进行重组酶介导的等温扩增， 得到扩增产物； (2)将所述扩增产物与CRISPR反应混合物混合反应， 所述CRISPR反应混合物包括 crRNA、 CRIS PR‑Cas蛋白、 s sDNA报告分子和CRIS PR反应缓冲液； 在混合反应过程中监测荧光信号或者将混合反应的反应产物以测流免疫层析试纸条 进行检测； 优选地， 所述混合反应的反应体系中， crRNA的浓度为95 ‑105nM， CRISPR ‑Cas蛋白的浓 度为95‑105nM， ssDNA报告分子的浓度为190 ‑210nM， CRIS PR反应缓冲液的浓度为1 ×。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述重组酶介导的等温扩增为在37℃孵 育15‑20分钟； 和/或， 所述混合反应为在37℃孵 育25‑40分钟。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115125315 A 2用于产毒型霍乱弧菌 血清群O1和O139鉴定的试剂盒和方 法 技术领域 [0001]本发明涉及微生物检测技术领域， 具体涉及用于产毒型霍 乱弧菌血清群O1和O139 鉴定的试剂盒和方法。 背景技术 [0002]霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio  cholerae)引发的急性肠道传染病， 发病急， 传播迅 速， 对公共健康造成不利影响。 霍乱弧菌是一种具有 单鞭毛的逗号形革兰氏阴性杆状菌， 运 动活泼， 可通过受污染的水和/或食物传播， 并引起急性水样腹泻病。 按照菌体脂多糖抗原 的不同， 已分离出210余个血清群， 其中霍乱弧菌O1群和O139群产毒株会导致霍乱流行。 及 早发现和确认霍乱病例对迅速实施干预措施至 关重要。 根据 《霍乱防治手册》 (图1)， 检测 霍 乱弧菌O1群和O139群产毒株需要一个耗时且复杂的过程， 需要将样本增菌培养后选择性培 养， 再挑取可疑菌落进行血清学鉴定和PCR检测， 整个过程至少要花费两天时间， 并且需要 良好的实验室基础设施和有经验的工作人员； 聚合酶链反应(Polymerase  chain  reaction,PCR)和实时定量PCR(Quantitative  Real‑time PCR,qPCR)加快了诊断速度， 但 依赖昂贵的大型仪器和良好的实验条件， 在资源匮乏的偏远地区难以实现， 因此快速诊断 检测是早期发现产毒霍乱弧菌血清群O1/O139的重要工具。 [0003]CRISPR‑Cas(规律间隔成簇短回文重复序列和CRISPR相关蛋白)系统是广泛存在 于古生菌和细菌中的适应性免疫系统， 由Cas效应蛋白和CRISPR  RNA(crRNAs)组成。 CRISPR 介导的免疫系统依赖于crRNAs对外源核酸进行序列特异 性检测和沉默， 从而保护 细菌免受 病毒和噬菌体的侵袭。 到目前为止， 许多CRISPR ‑Cas系统， 如Cas9、 Cas12、 Cas13已被用于诊 断功能， 由于其高灵活性、 敏 感性和特异性， 在即时检验(point ‑of‑care testing， POCT)中 具有较大的潜力。 [0004]重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase  Aided Amplificat ion， RAA)是一种利 用重组酶、 单链结合蛋白和DNA聚合 酶在恒温条件 下(一般为37℃ ‑42℃)扩增DNA的方法， 不 需要依赖昂贵的大 型仪器。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒以及鉴 定产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139的方法。 [0006]具体地， 本发明提供以下技 术方案： [0007]本发明提供用于产毒型霍 乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒， 所述试剂盒包含 引物组、 crRNA、 CRIS PR‑Cas蛋白和s sDNA报告分子； [0008]所述引物组包含三个引物对， 分别针对以下靶基因： 霍 乱弧菌ctxA基因、 O1群霍 乱 弧菌O抗原编码决定 簇特异基因和O139群霍乱弧菌O抗原编码决定 簇特异基因； [0009]所述crRNA包括三个crRNA， 分别针对所述三个引物对扩增得到的DNA片段中的靶 序列；说　明　书 1/8 页 3 CN 115125315 A 3