(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210733835.2 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 上海柏辰生物科技有限公司 地址 200000 上海市青浦区盈 港东路6868 号1幢二层209室 (72)发明人 孙亚蒙　郭美君　徐军　邢晓娇　 周建忠　 (74)专利代理 机构 上海宣宜专利代理事务所 (普通合伙) 3128 8 专利代理师 刘雪怡 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引 物探针组合及反应 体系 (57)摘要 本申请涉及用于T790M和C797S突变及顺反 式检测的引物探针组合及反应体系， 涉及基因检 测技术领域， 其包括靶 标引物探针与内参引物探 针； 所述靶标引物 探针序列如： SEQ  ID No： 1、 SEQ   ID No： 2、 SEQ  ID No： 3、 SEQ  ID No： 4、 SEQ  ID  No： 5； 所述内参引物探针序列如： SEQ  ID No： 6、 SEQ ID No： 7、 SEQ  ID No： 8、 SEQ  ID No： 9。 本发 明的反应体系引物探针特异性良好、 灵敏度高、 适用样本范围广等为快速准确检测T790M和 C797S突变频率及顺反式提供了一种很好的方 法。 权利要求书2页 说明书9页 附图1页 CN 114921557 A 2022.08.19 CN 114921557 A 1.一种探针法数字PCR检测T790M和C797S突变频率及顺反式的引物探针序列， 其特征 在于： 包括靶标引物探针与内参引物探针； 所述靶标引物探针序列如： SEQ  ID No： 1、 SEQ  ID No： 2、 SEQ  ID No： 3、 SEQ  ID No： 4、 SEQ ID No： 5； 所述内参引物 探针序列如： SEQ  ID No： 6、 SEQ  ID No： 7、 SEQ  ID No： 8、 SEQ  ID  No： 9。 2.一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M， C797S双靶标突变且可计算突变频率 的方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： 步骤一： 以待测样品的DNA为模板， 进行探针法数字PCR扩增， 获得PCR扩增产物； 步骤二： 检测微滴 中扩增产物的荧光信号， 由QuantaSoft完成对数据的自动处理， 获得 靶序列在PCR反应 体系中的拷贝数浓度； 步骤三： 突变频率 ＝突变拷贝数/内参拷贝数*10 0％； 其中用于PCR扩增的体系中含有检测T790M， C797S双靶标突变的引 物探针和内参引 物 探针， 所述靶标引物探针的序列如： SEQ  ID No： 1、 SEQ  ID No： 2、 SEQ  ID No： 3、 SEQ  ID No： 4、 SEQ ID No： 5其中T790M探针为HEX标记， C797S探针为FAM标记； 所述内参的引物探针序列 如： SEQ ID No： 6、 SEQ  ID No： 7、 SEQ  ID No： 8、 SEQ  ID No： 9； 两条探针分别用FAM、 HE X标记， 使用时FAM： H EX＝1:1使扩增微 滴与突变微 滴区分。 3.根据权利 要求2所述的一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M， C797S双靶标突 变且可计算 突变频率的方法， 其特 征在于： 所述扩增条件如下： 反应体系： 2 ×ddPCRTM Supermix  for Probes 10 μL， DNA模板10ng， Pr imer Mix 2 μL， 去 离子水至20 μL； 其中Primer  Mix为浓度100um的靶标引物上下游1.8 μL,探针1μL,以及去离 子水13.4 μL的混物1 μL； 浓度为100um的内参引物上下游1.8 μL,探针1 μL,以及去离子水14.4 μL的混合物1 μL； 反应条件： 95℃， 10mi n； 94℃， 3 0s； 60℃， 60s， 40循环； 98℃， 10mi n。 4.一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M， C797S双靶标突变可判断顺反式的方 法， 其特征在于， 包括如下步骤： 步骤一： 以待测样品的DNA为模板， 进行探针法数字PCR扩增， 获得PCR扩增产物； 步骤二： 检测微滴 中扩增产物的荧光信号， 由QuantaSoft完成对数据的自动处理， 获得 靶序列在PCR反应 体系中的拷贝数浓度， 微 滴数； 步骤三： 配合使用自主研发的顺反式判读小程序， 判读T790 M和C797S顺反式； 其中用于PCR扩增的体系中含有检测T790M， C797S双靶标突变的引物探针， 所述靶标引 物探针的序列如： SEQ  ID No： 1、 SEQ ID No： 2、 SEQ ID No： 3、 SEQ ID No： 4、 SEQ ID No： 5。 5.根据权利 要求4所述的一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M， C797S双靶标突 变可判断顺反式的方法， 其特 征在于： 所述扩增条件如下： 反应体系： 2 ×ddPCRTM Supermix  for Probes 10 μL， DNA模板10ng， Pr imer Mix 2 μL， 灭 菌无核酶H2O至20 μL； 其中Primer  Mix为浓度100um的靶标引物上下游1.8 μL,探针1 μL,以及 去离子水13.4 μL的混合物； 反应条件： 95℃， 10mi n； 94℃， 3 0s； 60℃， 60s， 40循环； 98℃， 10mi n。 6.一种用于检测T790M， C797S突变频率及顺反式的试剂盒,其特征在于： 包括以下试 剂：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114921557 A 2(1)检测T790M， C797S双靶标突变频率的引物探针； 检测GAPDH内参拷贝数的引物探针； 其中， 所述靶标T79 0M， C797S引物探针的序列如： SEQ  ID No： 1、 SEQ  ID No： 2、 SEQ  ID No： 3、 SEQ ID No： 4、 SEQ  ID No： 5， 所述内参的引物探针序列如SEQ  ID No： 6、 SEQ  ID No： 7、 SEQ   ID No： 8、 SEQ ID No： 9； (2)其他试剂包括灭菌无核酶H2O、 2 ×ddPCRTM Supermix  for Probes、 微滴生成油、 微 滴阅读油、 阳性 参考品、 阴性 参考品和标准品中的一种或多种。 7.根据权利要求6所述的一种用于检测T790M， C797S突变频率及顺反式的试剂盒在检 测790M， C797S突变及顺反式中的应用， 其特征在于： 本试剂盒具有： 特异性好、 灵敏度高、 适 用样本范围广等优点； 其中 (1)特异性好： 在高浓度野生型基因组DNA反应中均无突变扩增或检测到的突变微滴数 ＜2个； (2)灵敏度高： 在10ng  DNA背景下的检测灵敏度最高可达 到0.1％； (3)适用样本范围广： 可用于新鲜组织， F FPE， 冰冻组织、 血 液、 胸水、 脑脊液等样本 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114921557 A 3