(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210701661.1 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 沈阳市妇婴医院 地址 110010 辽宁省沈阳市沈河区大南 街 87号 (72)发明人 赵艳辉　孙晓　王晓彩　庞泓　 (74)专利代理 机构 沈阳东大知识产权代理有限 公司 21109 专利代理师 马海芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检 测方法 (57)摘要 用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检 测方法， 属于分子生物学技术领域， 该方法用于 对基因组 中MAGEL2 基因进行表 达分析， 进而对染 色体15q11.2 ‑q13区域PWS印记区的印记状态进 行评估， 以达到快速简便、 准确度高的效果。 本发 明所采用的检测方法具有快速、 高通量、 所需标 本量少、 价格低廉、 操作简单的优点， 所需仪器设 备为实验室 常用设备， 易于临床实验室开展。 权利要求书2页 说明书4页 序列表4页 附图1页 CN 114959015 A 2022.08.30 CN 114959015 A 1.一种用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法， 其特征在于， 其特征在于， 包 括选择检测的组织类型、 检测项目及内容、 判断标准； 组织类型： 胎盘组织； 检测项目及内容： 对胎盘组织中的mRNA进行提取， 进行MAGEL2基因的PCR检测； 所述PCR 检测过程还包括引入内参基因ACTB， 选择扩增片段， 设定与MAGEL2基因扩增产物相近的Tm 值； 判断标准： 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 检测结果： 若内参基因ACTB有扩增条带， 同时 MAGEL2有扩增条带， 则间接证明染色体15q11.2 ‑q13印记区域有表达； 若内参基因ACTB有扩 增条带， 同时MAGEL2无扩增条 带， 则间接证明染色体15q1 1.2‑q13印记区域无表达 。 2.根据权利要求1所述的用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法， 其特征在 于， 内参基因引物序列： 序列(5'‑>3') 上游引物： CATGTACGT TGCTATCCAGGC 引物长度： 21bp 模板起始位置： 47 7 模板终止位置： 497 Tm： 59.13℃ GC： 52.38％ 下游引物： CTC CTTAATGTCACGCACGAT 引物长度： 21bp 模板起始位置： 70 6 模板终止位置： 726 Tm： 58.46℃ GC： 47.62％ 目标产物 >NM_001101.5Homo sapiens actin beta(ACTB),mRNA 产物长度＝25 0bp。 3.根据权利要求1所述的用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法， 其特征在 于， MAGEL2基因引物序列： 序列(5'‑>3') 上游引物： C CTGGGCTCCGCTAAATCATT 引物长度： 21bp 模板起始位置： 2 246 模板终止位置： 2 266 Tm： 60.48℃ GC： 52.38％ 下游引物： TCATGCG GTCTTTTGAAGGGG 引物长度： 21bp权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114959015 A 2模板起始位置： 23 56 模板终止位置： 2376 Tm： 60.89℃ GC： 52.38％ 目标产物 >NM_0190 66.5Homo sapiens MAGE family member L2(MAGEL2),mRNA 产物长度＝131bp。 4.根据权利要求1所述的用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法， 其特征在 于， 所述PCR扩增反应 体系及反应条件如下： 反应体系： 将cDNA模板1 ‑4μl， 引物0.5 ‑2μl， dNTP  0.5‑2μl， 10xPCR缓冲液2.5 ‑10μl， MgCl2溶液 2.0‑8μl， Taq DNA聚合酶1 ‑4U混合， 加水补足至25 ‑100μl； 其中， cDNA模板浓度为20 ‑ 1000ng/ μl， 引物浓度为5 μM， dNTP浓度为10mM， MgCl2溶液浓度为25m mol/L； 反应条件： 95℃起始变性4min； 95℃变性40sec， 58 ‑61℃退火40sec， 72℃延伸40sec， 35个循环； 72 ℃延伸10mi n。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114959015 A 3