(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210719618.8 (22)申请日 2022.06.23 (71)申请人 香港中文大 学 （深圳） 地址 518100 广东省深圳市龙岗区龙城街 道龙翔大道 2001号 (72)发明人 刘国珍　龙轶　 (74)专利代理 机构 北京鼎德宝 专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 11823 专利代理师 王媛 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12P 19/34(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) G01N 33/68(2006.01)G01N 33/58(2006.01) (54)发明名称 环状核酸分子、 其制备方法以及 核酸探针和 检测方法 (57)摘要 发明公开了一种环状核酸分子、 其制备方法 以及核酸探针和检测方法， 涉及分子检测技术领 域。 该环状核 酸分子其不含碱基C， 其线性核苷酸 序列为(GGTTATTATT)n， 其中， n≥3。 本发明公开 的环状核酸 分子仅含有三种碱基， 且 具有最少二 级结构的重复序列， 以此序列为模板进行 RCA， 具 有较高的扩增效率和更高的与单链DNA信号探针 结合的效率， 因此检测更高效， 灵敏度更高。 可广 泛适用于信号放大、 纳米结构、 生物传感、 分子诊 疗等领域。 权利要求书2页 说明书9页 序列表1页 附图8页 CN 114854736 A 2022.08.05 CN 114854736 A 1.一种适用于RCA反应作为模板获取长单链核酸分子的环状核酸分子， 其特征在于， 其 不含碱基C， 其线性核苷酸序列为(G GTTATTATT)n， 其中n≥3； n 为整数。 2.根据权利要求1所述的环状核酸分子， 其特 征在于， n ＝4‑6， 优选地， n ＝5。 3.根据权利要求1或2所述的环状核酸分子， 其特征在于， 所述环状核酸分子的线性核 苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示： G GTTATTATTGGTTATTATTGGTTATTATTGGTTATTATTGGTTATTATT。 4.一种用于制备如权利要求1 ‑3任一项所述的环状核酸分子的前体核酸分子， 其特征 在于， 其为直链结构， 其 通过成环反应形成如权利要求1 ‑3任一项所述的环状核酸分子； 优选地， 所述前体核酸分子的核苷酸序列为P ‑(GGTTATTATT)n， 其中n≥3， n为整数， P为 磷酸基团。 5.根据权利要求 4所述的前体核酸分子， 其特 征在于， n ＝4‑6， 优选地， n ＝5。 6.如权利要求1 ‑3任一项所述的环状核酸分子的制备方法， 其特征在于， 其包括： 成环 反应步骤， 所述成环反应步骤包括： 将权利要求4或5所述的前体核酸分子置于成环反应体系中进 行反应以获得 所述环状核酸分子 。 7.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 所述成环反应体系含有环化连接酶、 ATP、 氯化锰、 以及缓冲液。 8.根据权利要求6或7所述的制备方法， 其特征在于， 进行环化反应的条件为： 58 ‑62℃ 孵育0.5‑1小时， 80 ‑99℃孵育8‑12分钟。 9.一种进行RCA反应以获取长单链核酸分子的方法， 其特征在于， 其包括： 使用权利要 求1‑3任一项所述的环状核酸分子作为模板进行RCA反应； 优选地， 进行RCA反应所用的引物序列如SEQ  ID NO.4所示。 10.由权利要求9的所述的方法得到的长链核酸分子 。 11.一种携带检测信号的核酸探针， 其特 征在于， 其包括： 至少一个主核酸链、 以及至少一个信号核酸链； 其中， 所述主核酸链为权利要求10所述 的长单链核酸分子； 所述信号核酸链与 所述主核酸链直接结合或间接结合， 所述信号核酸链修饰有可被检 测的信号标记 物； 所述主核酸链的端部用于与检测分子结合， 所述检测分子可 特异性结合靶标分子 。 12.根据权利要求11所述的核酸探针， 其特征在于， 所述信号核酸链与 所述主核酸链直 接互补结合； 优选地， 所述信号核酸链来自权利要求10所述的长单链核酸分子 。 13.根据权利要求11所述的核酸探针， 其特征在于， 所述信号核酸链通过至少一个支核 酸链与所述主 核酸链间接结合； 每个所述支核酸链包括： 头部区和尾部区， 所述头部区互补结合至所述主核酸链， 所述 尾部区互补结合至少一个所述信号核酸链。 14.根据权利要求11所述的核酸探针， 其特征在于， 所述信号核酸链通过至少一个第 一 支核酸链和至少一个第二支核酸链与所述主 核酸链间接结合； 每个所述第一支核酸链包括： 与所述主核酸链互补结合的第一头部区， 以及互补结合 至少一个所述第二支核酸链的第一尾部区；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114854736 A 2每个所述第 二支核酸链包括： 与 所述第一支核酸链的第 一尾部区互补结合的第 二头部 区， 以及互补结合至少一个所述信号核酸链的第二尾部区。 15.根据权利要求11 ‑14任一项所述的核酸探针， 其特征在于， 所述靶标结合区位于所 述主核酸链的5 ’端。 16.根据权利要求11 ‑14任一项所述的核酸探针， 其特征在于， 所述信号标记物为量子 点。 17.根据权利要求16所述的核酸探针， 其特征在于， 所述量子点选自Q525、 Q565、 Q585、 Q605、 Q625、 6 55、 Q705和Q800； 优选地， 所述靶标分子为蛋白或多肽， 所述检测分子为能特异性结合所述蛋白或所述 多肽的抗体； 优选地， 所述靶标分子为核酸片段， 所述检测分子为能与所述核酸片段互补结合的核 酸片段。 18.一种核酸探针结合物， 其特征在于， 所述核酸结合物包括检测分子、 以及连接在所 述检测分子上的如权利要求11 ‑17任一项所述的核酸探针， 所述检测分子可特异性结合靶 标分子。 19.一种抗体 ‑核酸探针结合物， 其特征在于， 所述抗体 ‑核酸结合物包括抗体、 以及连 接在所述抗体上的如权利要求11 ‑17任一项所述的核酸探针， 所述核酸探针的端部连接至 所述抗体， 所述检测分子为所述 抗体。 20.一种单分子超灵敏度POCT检测蛋白质的方法， 其特征在于， 其包括： 使用如权利要 求11‑17任一项所述的核酸探针， 或如权利要求18所述的核酸探针结合物， 或如权利要求19 所述的抗体 ‑核酸探针结合物进行检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114854736 A 3