(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210687849.5 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 中国农业大 学 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 中国农业大 学(西校区) (72)发明人 顾日良　郭莎莎　艾俊民　王建华　 杜雪梅　李莉　 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C07K 14/415(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 玉米种子耐贮性相关的ZmRAP2.7基因及其 功能标记与应用 (57)摘要 本发明涉及作物分子育种、 分子生物学和基 因工程领域， 特别涉及了一种玉米种子耐贮性相 关的ZmRAP2.7基因克隆鉴定及在提高种子耐贮 性中的应用。 我们采用全基因组关联分析法， 获 得与种子人工加速老化发芽率显著关联的4个 SNP， 落在ZmRAP2.7基因上。 该基因的Mu插入 突变 体和CRISPR ‑Cas9敲除系的耐贮性显著下降。 转 录组分析 发现该基因功能缺失导致ABA信号传导 功能异常； 酵母 单杂和凝胶阻滞证实该蛋白能结 合到ZCN9和3个ABA信号传导基因启动子上转录 抑制基因表达。 四个显著关联SNP造成该蛋白氨 基酸序列改变， 进而影 响与ZCN9等启动子的结合 活性， 导致不同单倍型自交系的耐贮性差异。 权利要求书1页 说明书10页 序列表11页 附图4页 CN 114836441 A 2022.08.02 CN 114836441 A 1.一种玉米种子耐贮性相关的ZmRAP2.7基因克隆鉴定及在提高玉米种子人工加速老 化萌发率、 增强种子耐贮性中的应用， 其特征在于： 种子经过模拟长时间贮藏的人工加速老 化处理后， 进行种子萌发时， 上调该基因的表达， 可提高种子的萌发率； 所述基因ZmRAP2.7 的DNA序列是如下1)的DNA序列或2)的cDNA序列； 所述基因ZmRAP2.7的蛋白序列是如下3)的 蛋白序列； 1)如SEQ ID NO.1所示的DNA序列； 2)如SEQ ID NO.2所示的cDNA序列； 3)如SEQ ID NO.3所示的蛋白序列。 2.根据权利要求1所述用途， 其特征在于： 种子经过人工加速老化处理后， 进行萌发时 上调该基因的表达， 其蛋白能结合到下游基因ZmABI5、 ZmPP2C、 ZmPYL3和ZCN9的启动子上转 录抑制这些基因的表达， 进而促进种子的萌发， 所述启动子ZmABI5是如下4)的DNA序列； 所 述启动子ZmPP2C是如下5)的DNA序列； 所述启动子ZmPYL3是如下6)的DNA序列； 所述启动子 ZCN9是如下 7)的DNA序列； 4)如SEQ ID NO.4所示的DNA序列； 5)如SEQ ID NO.5所示的DNA序列； 6)如SEQ ID NO.6所示的DNA序列； 7)如SEQ ID NO.7所示的DNA序列。 3.根据权利要求1所述用途， 其特征在于： 其中抑制所述基因ZmRAP2.7的表达， 以便获 得低人工加速老化发芽率的突变体材料， 用于挖掘更多与种子萌发相关的生物合成途径， 以及挖掘其分子 机理， 为高品质玉米的选 育奠定基础。 4.一种玉米种子耐贮性相关的ZmRAP2.7基因分子标记ZmRAP2.7 ‑P1的检测引物对， 其 特征在于， 所述检测引物对包括但不限于第一引物ZmRAP2.7 ‑F1： CACCAGTTCGCCAGGTAGTT， 如SEQ ID NO.12所示； 第二引物ZmRAP2.7 ‑R1： TATGTACCTGCACCCAAGCA， 如SEQ  ID NO.13所 示。 5.一种影响耐贮性相关的ZmRAP2.7基 因分子标记ZmRAP2.7基因分子标记ZmRAP2.7 ‑P2 的检测引物对， 其特征在于， 所述检测引物对包括但不限于第一引物ZmRAP2.7 ‑F2： GTGGCTAGGGAATTCCTCCAAT， 如SEQ  ID NO .14所示； 第二引物ZmRAP2 .7 ‑R2： GCAGCTAGCA AGTACGTC CA， 如SEQ ID NO.15所示。 6.权利要求4、 5所述的分子标记， 能够将368份自交系组成的关联群体分型， 根据所述 分子标记能够将群体 分为Hap1和Hap2， 且Hap1单倍型的人工加速老化 发芽率显著低于Hap2 单倍型。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836441 A 2玉米种子耐贮性相关的ZmRAP2.7基因及其功能标记与应用 技术领域 [0001]本发明属于作物分子育种、 分子生物学和基因工程领域， 涉及一种玉米种子耐贮 性相关的ZmRAP2.7基因及其编码蛋白序列， 具体涉及一个控制玉米种子人工加速 老化萌发 和耐贮性相关基因ZmRAP2.7的克隆及应用。 背景技术 [0002]种子是基本 的农业生产资料， 高活力种子具有明显 的生长优势和生产潜力， 是保 证作物高产稳产的基础。 作物种子需要经历一段时间的贮藏才能用于播种， 而贮藏过程中 种子会逐步 发生劣变， 导致活力下降， 甚至造成种子报废或播后无法出苗的农业生产事故。 挖掘耐贮藏基因， 并应用到育种中， 是提高种子耐贮藏特性的有效方法， 对提高种子田间出 苗质量和作物高产稳产具有重要意 义。 [0003]种子耐贮性的本质是种子在经过一定时间的贮藏后， 种子萌发能力的保持能力， 因此耐贮性评价最直接的方法是将种子在特定环 境中贮藏一定时间后进 行发芽能力测定， 根据发芽率来评价种子耐贮性。 但这种方法耗时长、 效率低。 人工加速 老化发芽法是采用高 温高湿的条件来处理种子， 一般经过几天的处理后， 种子的劣变程度可以达到贮藏几年的 效果， 因此被广泛用来评价种子的耐贮性。 [0004]近年来， 利用人工加速老化 的方法， 在拟南芥、 大豆、 鹰嘴豆、 向日葵和 水稻中， 通 过不同的正向遗传学和反向遗传学手段， 克隆了一些耐贮藏相关基因， 促进了对种子耐贮 性遗传机理的理解。 对于目前已克隆的大部 分基因， 根据其 发挥功能的方式不同， 大致可分 为保护类基因和修复类基因。 保护类基因主要与种皮成分、 非还原性糖含量、 热激响应因 子、 氧化还原反应相关。 其中以氧化还原反应相关的基因报道最多， 如拟南芥中维生素E编 码基因VITAMIN  E1(VTE1)和VTE2可限制贮藏过程中非酶脂质氧化的物质增加， 1 ‑cys  peroxire doxin(PER1)基因可消除半胱氨酸残基产生的活性氧， 水稻Aldo ‑ketoreductase  1(AKR1)基因有助于降低脂质过氧化过程产生的丙二醛等活性羰基化合物， lipoxygenase (LOX)基因可有助于减少不饱和脂肪酸的氧化反应。 修复类基因主要与DNA和蛋白的修复过 程相关。 L ‑异天冬氨酰甲基转移酶编码基因Protein  L‑isoaspartyl  methyltransferase (PIMT)， 在拟南芥、 水稻、 鹰嘴豆中被报道可有效减少L ‑异天冬氨酸残基在种子中的积累， 促进种子寿命和发芽活力的提高。 苜蓿中蛋氨酸亚砜还原酶编码基因methionine   sulfoxide reductases(MSR)， 可有效阻止蛋氨酸氧化成蛋氨酸亚砜， 延长种子寿命。 此外， 拟南芥中DNA连接酶VI， DNA糖基化酶OGG1等被报道在种子老化过程中参与DNA损伤的修复 过程。 [0005]值得注意的是， 转录因子 由于可同时调控多个下游基因， 常常位于保护类和修复 类基因的上游， 可从多个层面调控种子的耐贮性。 其中以脱落酸ABA、 赤霉素GA和生长素三 个激素途径中的转录因子报道最多。 ABA途径中的ABSCISIC  ACID INSENSITIVE3(ABI3)基 因属于植物特有的B3转录因子家族， 其与LEAFY  COTYLEDON  1(LEC1)、 LEC2和 FUS3FUSCA3 (FUS3)三个转录因子共同调节种子的成熟过程， 突变后造成种子耐贮藏能力下降。 保护类说　明　书 1/10 页 3 CN 114836441 A 3