(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210575458.4 (22)申请日 2022.05.25 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 李青　许强　李若楠　李林　李娟　 韩瑞　 (74)专利代理 机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 1 1401 专利代理师 张晓博 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C40B 50/06(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6869(2018.01) G16B 20/30(2019.01) (54)发明名称 玉米基因组目标区段的DNA甲基化检测 (57)摘要 本申请公开了玉米基因组目标区段的DNA甲 基化检测， 具体涉及包含目标区段的玉米基因组 DNA甲基化检测文库的构建方法、 检测方法、 试剂 盒和系统。 该方法、 试剂盒和系统通过两次PCR扩 增构建DNA甲基化检测文库， 再通过对DNA甲基化 检测文库测序和DNA甲基化信息比对实现检测。 该方法、 试剂盒和系统可一次性检测多份玉米材 料中多个目标区段的DNA甲基化信息， 也可应用 于杂交材料两个亲本等位基因的DNA甲基化的检 测， 每一所述目标区段应包含至少一个或多个能 够区分不同玉米材料或不同等位基因的SNP位 点， 本申请在准确检测DNA甲基化水平的同时， 既 简化了繁琐的实验操作， 也极大降低了检测成 本。 权利要求书3页 说明书12页 序列表4页 附图5页 CN 115161408 A 2022.10.11 CN 115161408 A 1.包含目标区段的玉米基因组的DNA 甲基化检测文库的构建方法， 所述目标区段包含 至少一个或多个能够区分不同玉米基因组的SNP位点， 所述DNA甲基化检测文库用于检测包 含所述目标区段的至少两个玉米 基因组的DNA混合样本， 其中， 所述构建方法包括： 将所述DNA混合样本中DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶； 进行第一扩增， 所述第一扩增包括对所述DNA混合样本在同一PCR反应体系中进行扩增 得到第一扩增产物， 所述第一扩增产物包含具有所述 目标区段的DNA分子以及连接在所述 DNA分子的3'端的第一识别序列和桥序列， 所述第一识别序列用以标识所述DNA混合样 本中 目标区段的每一条DNA分子； 进行第二扩增， 所述第二扩增包括对所述第一扩增产物进行PCR扩增得到第二扩增产 物的步骤， 所述第二扩增产 物包含第一扩增产物以及连接在所述第一扩增产物3'端的第二 识别序列， 所述第二识别序列用于对所述第一扩增产物进行 标识； 以及 利用所述第 二扩增产物构建所述包含所述目标区段的玉米基因组 的DNA甲基化检测文 库。 2.根据权利要求1所述的构建方法， 其中， 所述第 一扩增使用了上游引物和第 一下游引 物， 所述上游引物中的C碱基 设计成为简并碱基Y； 所述第一下游引物中的G碱基设计成为简 并碱基R， 所述第一下游引物包 含所述第一识别序列以及桥序列； 所述第一扩增产物中的SNP位点位于所述目标区段的DNA分子与所述上游引物结合起 始位置或与所述第一下游引物结合起始 位置的150bp以内， 以保证SNP位点能够在后续测序 中被检测到。 3.根据权利要求2所述的构建方法， 其中， 所述第一扩增的反应步骤 包括： 进行预变性， 处 理温度为95℃， 处 理时间为5mi n； 进行第一扩增循环， 所述第一扩增循环包括依次进行第一解链处理、 第一退火处理和 第一延伸处 理； 进行第二扩增循环， 所述第二扩增循环包括依次进行第二解链处理、 第二退火处理和 第二延伸处 理； 以及 72℃处理5min和12℃处 理1s； 其中， 所述第一扩增循环包括至少8～12次循环， 所述第 一退火处理的处理温度随所述 第一扩增循环的循环次数增 加而逐次降低。 4.根据权利要求3所述的构建方法， 其中， 所述第一退火处理的处理温度为68 ‑55℃、 65‑53℃、 65‑55℃或63‑55℃。 5.根据权利要求1所述的构建方法， 其中， 所述第 二扩增使用了所述上游引物和第 二下 游引物， 所述第二下游引物包 含所述第二识别序列， 所述第二扩增的反应步骤 包括： 进行预变性， 处 理温度为95℃， 处 理时间为5mi n； 进行扩增循环， 所述扩增循环包括依次进行解链处 理、 退火处 理和延伸处 理； 以及 72℃处理5min和12℃处 理1s。 6.根据权利要求5所述的构建方法， 其中， 所述第 二扩增产物还包括连接在所述第 一扩 增产物3'端的所述第一识别序列与所述第二识别序列之 间的桥序列， 所述桥序列用以连接 所述第一识别序列和所述第二识别序列。 7.玉米基因组目标区段DNA 甲基化的检测方法， 所述目标区段包含至少一个或多个能权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115161408 A 2够区分不同玉米基因组的SNP位点， 所述目标区段DNA甲基化检测方法用于检测包含 所述目 标区段的至少两个玉米 基因组的DNA混合样本， 其中， 所述检测方法包括： 权利要求1～6任一项所述的构建方法， 构建包含所述目标区段的玉米基因组的DNA甲 基化检测文库； 对所述DNA甲基化检测文库进行测序， 以获得第一reads库； 对所述第一reads库进行质控、 拆分和组对得到第二reads库； 对所述第二reads库进行比对、 去重和计算， 即得到所述DNA混合样本中每一玉米基因 组的DNA甲基化信息 。 8.根据权利 要求7所述的检测方法， 其中， 所述第一reads库包括与所述DNA甲基化检测 文库对应数量的第一reads， 所述第二reads库包括基于相同所述第二识别序列组成的第二 reads， 所述第二reads为去除了所述第一识别序列、 所述第二识别序列和所述桥序列的 reads。 9.用于构建包含目标区段的玉米基因组的DNA 甲基化检测文库的试剂盒， 所述目标区 段包含至少一个或多个能够区分不同玉米基因组的SNP位点， 所述DNA甲基化检测文库用于 检测包含所述目标区段的至少两个玉米 基因组的DNA混合样本， 其中， 所述试剂盒包括： 玉米基因组DNA处理试剂， 用于提取所述玉米基因组DNA并将其中未发生甲基化的胞嘧 啶转变成为尿嘧啶； 上游引物， 所述上游引物序列中的C 碱基替换成为简并碱基Y的序列； 第一下游引物， 所述第一下游引物序列中的G碱基替换成为简并碱基R的序列， 所述第 一下游引物包 含第一识别序列和桥序列； 以及 第二下游引物， 所述第二下游引物包 含所述桥序列和第二识别序列序列； 其中， 所述上游引物和所述第一下游引物用于进行一次第一扩增得到第一扩增产物， 所述第一扩增产物包含具有所述目标区段的DNA分子以及连接在所述DNA分子的3'端的第 一识别序列和桥序列； 所述上游引物和所述第 二下游引物可于一 次第二扩增中得到第 二扩增产物， 所述第 二 扩增产物包含第一扩增产 物以及连接在所述第一扩增产 物3'端的第二识别序列， 以构建所 述DNA甲基化检测文库； 所述第一识别序列用以标识所述DNA混合样本中所述目标区段的每一条DNA分子， 所述 第二识别序列用于对所述第一扩增产物进行 标识。 10.包含目标区段的玉米基因组DNA甲基化检测的系统， 所述目标区段包含至少一个或 多个能够区分不同玉米基因组的SNP位点， 所述DNA甲基化检测文库用于检测包含所述目标 区段的至少两个玉米 基因组的DNA混合样本， 其中， 所述系统包括： 权利要求9所述的试剂盒， 用于获得所述DNA混合样本中每一玉米基因组的DNA甲基化 信息； 以及 处理装置， 所述处理装置用于运行程序， 所述程序运行时执行权利要求7或8所述检测 方法中的 “对所述DNA甲基化检测文库进行测序， 以获得第一reads库； 对所述第一reads库进行质控、 拆分和组对得到第二reads库； 对所述第二reads库进行比对， 去重和计算， 即得到所述DNA混合样本中每一玉米基因权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115161408 A 3