(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210937082.7 (22)申请日 2022.08.05 (71)申请人 菏泽学院 地址 274015 山 东省菏泽市牡丹区菏泽市 大学路2269号菏泽学院 (72)发明人 侯少阳　孙林慧　彭倩　韩仁皓　 李典　 (74)专利代理 机构 济南泉城专利商标事务所 37218 专利代理师 刘庆兰 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物和探针 及其应用 (57)摘要 本发明属于生物菌种检测技术领域， 涉及一 种特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物和探针及 其应用。 本专利通过ERIC ‑PCR技术， 以一株乳酸 片球菌HP ‑B1099为基础， 设计并获得两 条引物探 针， 可简单快速的实现复杂样 本中微量乳酸片球 菌的检出， 解决了传统方法的弊端。 可在八种基 因组DNA或八种菌株 混合液及多株近缘菌株中快 速特异性地鉴别极低浓度的乳酸片球菌， 大大提 高了检测的效率。 此方法在人和动物肠道菌群生 态结构研究、 医药健康、 畜牧养殖及商业化生产 与运用等方面具有广泛的应用前 景。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 115232883 A 2022.10.25 CN 115232883 A 1.特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物和探针， 其特 征在于， 引物序列为： 上游ERIC ‑F‑N： 5’ ‑AAAGTAAGTGRCTG GGUTGAGCGC‑3’， 下游ERIC ‑R‑N： 5’ ‑AATGTAAGCVCCTGGGRATTCACA‑3’； 探针序列为： 1099‑750‑F: （5’ ‑TGGAATCACACATCACAC CAGG‑3’） ， 1099‑750‑R: （5’ ‑GTTGTCCTGGACTCTCCAAATC‑3’） ； 1099‑3‑F: （5’ ‑GTGCCATTGAACTAGCCGTGTTAC‑3’） ， 1099‑3‑R: （5’ ‑GCTTCCGCCATTCAATAAACGGAG‑3’） 。 2.权利要求1所述特异性检测鉴别 乳酸片球菌的引物和探针在乳酸片球菌检测试剂或 试剂盒中的应用。 3.乳酸片球菌检测的PCR反应 体系， 其特 征在于， 包含如下物质： DNA模板1 μl， 上下游引物各1  μl， 2×Taq Master Mix 12.5 μl， ddH2O 9.5 μl， 反应总 体积25 μl； DNA模板浓度100 ‑300 ng·mL‑1， 上下游引物浓度30 ‑50 μmol·L‑1， Mg2+浓度为 1.75‑5.0 mmol·L‑1； 反应程序为： 92‑98℃预变性8 ‑12 min， 92‑98℃变性1  min， 44‑46℃退火35 ‑45 s， 65‑78℃延伸210   s， 执行30‑34个循环， 16℃后延伸。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115232883 A 2特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物和探针及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物菌种检测技术领域， 涉及 一种特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物 和探针及其应用。 背景技术 [0002]乳酸片球菌， 细胞圆球状， 一般细胞成对生， 不成链状排列。 革兰氏阳性， 不运动， 兼性厌氧。 在MRS培养基上菌落小， 呈白色。 接触酶阴性， 不产细胞色素。 产酸， 调节胃肠道菌 群， 维持肠道微生态平衡， 促进身体新陈代谢。 在动物体内对病原微生物有颉颃作用， 可竞 争性地抑制病原 微生物， 在一定程度上保护有益菌的生长， 增强动物机体的免疫功能， 产生 有益的代谢产物， 激活酸性蛋白酶的活性， 参与机体的新陈代谢， 防止有害物质产生。 起到 调节肠粘膜电解质和水分平衡的作用， 促进胃液分泌， 增强消化功能， 可用于治疗消化不良 和慢性腹泻。 乳酸片 球菌能产生细菌素。 抗生素在抑制原菌增殖上发挥着重要作用， 但抗生 素的过度或不合理使用， 会使一些细菌产生耐药性。 并且会在体内残留积累， 而乳酸片 球菌 产生的细菌素， 可通过调节肠道菌群有效 改善疾病状态。 在畜牧业上的发展具有广阔前景， 将乳酸片球菌替代抗生素， 不仅有利于动物的胃肠道， 而且能增强免疫力， 抑制细菌感染， 降低抗生素对动物机体的损伤， 从而减少疾病的发生， 增殖增产。 [0003]由原卫生部 公布的 《可用于食品的菌种名单》 可知， 可用于食品的菌种包含21个菌 株， 乳酸片球菌因具有抗菌、 抗炎、 健脾养胃、 增强机体免疫作用。 市场上出现的含 可食用菌 种的乳酸片球菌产品更是层出不穷。 随着人们生活水平的提高， 快速检验众多产品中是否 含有乳酸片球菌， 成为亟需解决得问题。 目前， 分子学中通常采用16S  rRNA方法进 行基因组 扩增结合基因比对检出乳酸片球菌， 试验周期长， 花费较高。 肠杆菌基因间重复一致序列   ( enterobacterial  repetitive  intergenic  consensus sequence， ERIC)  广泛存在于肠 杆菌科细菌基因组中， 具有较强保守性， 依据此重复性序列设计引物， 对细菌基因组进行扩 增， 可以产生  DNA 指纹图谱， 用于细菌 分类鉴定。 但是目前针对乳酸片球菌检测， 还没有很 理想的检测方法被报道。 发明内容 [0004]本发明针对传统乳酸片球菌检测中存在的问题提出一种新型的特异性检测鉴别 乳酸片球菌的引物和探针及其应用。 [0005]为了达到上述目的， 本发明是采用下述的技 术方案实现的： 本专利通过ERIC ‑PCR技术， 以一株乳酸片球菌HP ‑B1099为基础， 设计并获得两条 引物探针， 可简单快速的实现复杂样本中微量乳酸片 球菌的检出， 解决了传统方法的弊端。 可在八种基因组DNA或八种菌株 混合液及 多株近缘菌株中快速特异 性地鉴别极低浓度的乳 酸片球菌， 大大提高了检测的效率。 此方法在人和动物肠道菌群生态结构研究、 医药健康、 畜牧养殖及商业 化生产与运用等方面具有广泛的应用前 景。 [0006]本发明基于新型ERIC ‑PCR技术进行乳酸片球菌HP ‑B1099基因组DNA的多态性扩说　明　书 1/8 页 3 CN 115232883 A 3