(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210870298.6 (22)申请日 2022.07.22 (71)申请人 河南科技大 学 地址 471000 河南省洛阳市涧西区西苑路 48号 (72)发明人 徐建强　侯小改　姜佳　柴秋源　 罗诗瑶　 (74)专利代理 机构 洛阳公信知识产权事务所 (普通合伙) 41120 专利代理师 王艳艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 牡丹枝孢霉的检测方法及在油用牡丹红斑 病诊断上的应用 (57)摘要 本发明属于油用牡丹红斑病检测诊断技术 领域， 具体涉及牡丹红斑病的检测方法及在油用 牡丹红斑病诊断上的应用。 将 筛选出针对牡丹红 斑病菌的LAMP特异性引物直接用于建立的LAMP 反应体系中并扩增目标DNA， 通过目标DNA的凝胶 电泳条带进行红斑病菌的特异性检测和LAMP颜 色反应的特异性检测诊断出牡丹红斑病。 本发明 建立的LA MP检测体系， 对于发病早期无明显病征 以及中后期有明显病征的病叶， 均能灵敏地实现 对红斑病的诊断。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 115094160 A 2022.09.23 CN 115094160 A 1.一种牡 丹红斑病菌的检测方法， 其特 征在于， 具体步骤如下： 步骤一、 筛选出针对牡丹红斑病菌的LAMP特异性引物， 所述LAMP特异性引物包括内引 物FIP/BIP和外引物F3 /B3； 步骤二、 建立LAMP反应体系并扩增目标DNA， 具体方法为： 将2.5  μL 10×ThermoPol   Buffer、 0.16  U/ μL Bst DNA聚合酶、 1  mmol/L dNTP、 8 mmol/L MgSO4、 0.2 μmol/L F3/B3、 0.6 mol/L 甜菜碱、 1.6  μmol/L FIP/BIP、 0.15  mmol/L HNB、 1 μL模板DNA， ddH2O补至25  μ L混匀后放入水浴锅中反应， 反应温度为6 0‑68 ℃， 反应时间为57 ‑63 min； 步骤三、 将步骤二中的扩增目标DNA进行红斑病菌的特异性检测以诊断出牡 丹红斑病。 2.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法， 其特征在于， 所述步骤一中LAMP 特异性引物的筛选方法： 利用MEGA软件对牡丹红斑病菌的ITS基因序列以及牡丹黑斑病菌、 腔孢叶斑病菌、 黄斑病菌、 灰霉病菌的ITS基因序列进行比对分析， 从中筛选出红斑病菌与 其他病菌序列同源性低的片段， 并将获得的基因片段在在线 软件上设计针对牡丹红斑病菌 的LAMP特异性引物。 3.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法， 其特征在于， 所述步骤二中扩增 结束后通过观察PCR管的颜色变化以及2 %琼脂糖凝胶电泳结果 来判断扩增反应是否进行。 4.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法， 其特征在于， 所述步骤二中模板 DNA为牡丹红斑病 、 牡丹黄斑病 、 牡丹灰霉病 、 牡丹黑斑病的总DNA。 5.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法， 其特征在于， 所述步骤三中的 LAMP反应的特异性检测的方法为： 设置阴性对照， 在LAMP反应体系中加入与其他处理组模 板等量的ddH2O代替， 将LAMP反应 体系进行LAMP反应的特异性检测。 6.一种牡丹红斑病菌的检测方法在油用牡丹红斑病诊断的应用， 其特征在于， 通过权 利要求1‑5任一项所述牡 丹红斑病菌的检测方法在油用牡 丹红斑病早期和中后期的诊断。 7.根据权利要求6所述一种牡丹红斑病菌的检测方法在油用牡丹红斑病诊断的应用， 其特征在于， 所述油用牡丹红斑病早期诊断检测： 采集类似牡丹红斑病的发病叶片， 将发病 部位剪下， 60 ‑70℃恒温水浴9 ‑11min后， 10000rp m离心8‑12min， 取上清液作为LAMP反应的 模板DNA， 以添加等量ddH2O的处理作为阴性对照， 同时以红斑病菌基因组DNA为阳性对照， 进行发病叶片的LAMP检测， LAMP反应结束后， 结合离心管颜色反应及凝胶电泳条带， 判断发 病叶片是否为红斑病。 8. 根据权利要求6所述一种 牡丹红斑病菌的检测方法在油用牡丹红斑病 诊断的应用， 其特征在于， 所述油用牡丹红斑病中后 期诊断检测： 选取病斑上有明显霉层的病叶， 用单面 刀片从病斑上刮取病菌的菌丝等病征， 放入2mL离心 管中， 加200  μL ddH2O后置于60 ‑70 ℃ 水浴锅中水浴5 ‑10 min， 然后10000  rpm离心8 ‑12 min， 吸取上清液做为模板DNA， 以添加等 量ddH2O的处理作为阴性对照， 进行发病叶片的LAMP检测， LAMP反应结束后， 结合离心管颜 色反应及凝胶电泳条 带， 判断发病叶片是否为红斑病。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094160 A 2牡丹枝孢霉的检测方 法及在油用牡丹红斑病诊断上的应用 技术领域 [0001]本发明属于油用牡丹红斑病检测诊断技术领域， 具体涉及牡丹红斑病菌的检测方 法及在油用牡 丹红斑病诊断上的应用。 背景技术 [0002]类似于人生病时去医院看病， 医生需要通过各项指标来判断病因及疾病种类。 植 物病害诊断也是需要通过各种方法， 鉴定病原物的种类， 进而对植物病害做出诊断， 并建议 生产中的施药选择。 而除了白粉病、 锈病、 霜霉病、 黑粉病等病征和病状典型的病害， 依据发 病部位的病状和病征可以直接作出判断； 对于大部分病害， 尤其是叶斑类病害， 病 征很少， 即使有病征， 也往往仅有菌丝而 无孢子， 依据发病部位形成的病征很难作出准确判断。 往往 需要将病菌从发病部位进行分离， 依据分离出 的病菌在培养基上产生的菌落、 形成的孢子 及产孢结构等， 作出准确判断； 而某些病菌如果不产孢， 则需培养后提取DNA， 进行DNA特异 性片段特异性扩增后测序， 依据 序列结果进行BLAST序列比对， 确认病菌归宿。 [0003]随着分子生物学技术的进步， 尤其是聚合酶链式反应 （Polymerase  Chain  Reaction， PCR） 的普及， 人们尝试采用普通PCR技术来对植物病害进行快速诊断。 操作步骤 如下： 从发病组织中提取DNA， 然后依据疑似的病原菌的保守序列设计引物， 进 行PCR扩增反 应； 扩增出条带后， 送至生物公司测序； 将所获得的序列在NCBI网站上比对， 依据得分高低 判断病菌归属。 [0004]相比于传统的病菌形态特征诊断结合病菌 的分离， 借助于普通PCR的植物病害的 分子诊断具有测 定结果准确、 不受病菌是否产孢等因素影响。 但该技术需要昂贵的PCR仪； 且由于需要进 行病原菌基因组保守序列搜索、 比对等， 对操作人员要求较高， 在生产中推广 应用难度较大。 [0005]牡丹不仅因其花大而香、 花色艳丽而具有极高的观赏价值， 而且根部含有抗菌消 炎物质——丹皮酚， 籽粒中含有42%以上的α ‑亚麻酸、 92%以上的不饱和 脂肪酸等数十种营 养成分， 使牡 丹同时具有很高的药用和食用价 值。 [0006]由牡丹红斑病菌引起的红斑病是牡丹上发病最严重的病害之一， 发病严重时可导 致牡丹叶片 干枯变黄， 植株生长势变弱、 产籽量减少， 花色衰退等， 对切花牡丹、 观赏牡丹以 及油用牡丹的产业化发展带来巨大 的威胁， 造成严重的经济损失。 牡丹红斑病主要危害茎 和叶片， 也能侵染叶柄、 嫩叶和枝。 一般下部叶片最先感病， 叶片发病初期叶正、 背面出现绿 色针头状小点， 以后扩展为直径  3～12mm 的紫褐色近圆形的病斑， 中央淡黄褐色， 边缘暗 紫褐色， 30d  后可扩展成10～30mm大小的病斑， 有的病斑相连成片， 大多数病斑有明显的同 心轮纹， 在病斑上呈现不整齐淡褐色轮状环纹和霉状物。 在潮湿的气候条件下， 病斑背面常 生墨绿色或灰褐色霉层， 似绒毛状， 为病菌的菌丝和分生孢子梗。 当病害侵染茎时， 茎上出 现紫褐色长圆形的病斑小点， 稍隆起， 病斑扩展缓慢， 后期病斑长径仅为  3～5mm； 病斑中间 开裂并下陷， 严重时病斑相连成片， 潮湿时病部也产生霉层， 常导致嫩枝枯死。 叶柄、 叶脉感 病后， 症状与茎相同。 萼片与花 瓣上病斑开始均为褐色小点， 严重时边 缘枯焦。说　明　书 1/6 页 3 CN 115094160 A 3