(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210636342.7 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学第一 附属医院 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正 街 30号 (72)发明人 阳莎　詹新宇　陈鸣　唱凯　罗洁　 陈志国　王彬潘　赵爽　汤晓琦　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 黄明光 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) (54)发明名称 熵驱动DNA链 置换四面体的microRNA 检测方 法及其应用 (57)摘要 本发明提供了熵驱动DNA链置换四面体的 microRNA检测方法及其应用， 涉及microRNA检测 技术领域。 本发明提供了熵驱动DNA四面体纳米 探针， 由P1 ‑P6六条单链DNA通过碱基互补配对得 到。 本发明利用DNA四面体的一条边作为双链复 合体， 一个顶点自组装燃 料链， 以DNA四面体作为 穿膜载体， 以熵驱动DNA链置换动态回路实现细 胞内靶标microRNA的无酶恒温级联放大， 可以实 现细胞内单个分子在微 ‑纳尺度的原位在体检 测， 具有良好的灵敏度和特异性。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 114934046 A 2022.08.23 CN 114934046 A 1.一种熵驱动DNA四面体纳米探针， 其特征在于， 所述DNA四面体纳米探针由一条含DNA 识别序列的单链DNA  P3和五条单链DNA  P1、 P2、 P4、 P5、 P6构成， 所述的DNA识别序列能够与 待测microRNA结合。 2.根据权利 要求1所述的熵驱动DNA四面体纳米探针， 其特征在于， 所述P1 ‑P6六条单链 DNA的序列如SEQ  ID NO.1～6所示。 3.根据权利 要求1所述的熵驱动DNA四面体纳米探针， 其特征在于， 所述P3单链DNA的第 38位碱基后修饰有荧 光基团， 所述P5单链DNA的3'端修饰有淬灭基团。 4.一种制备权利要求1所述熵驱动DNA四面体纳米探针的方法， 其特征在于， 所述方法 包括： 将P3、 P5、 P6单链DNA加入到缓冲液中， 经第一反应得到第一复合体； 将P1、 P2、 P4单链 DNA与第一复合体混合经第二反应即得 所述的熵驱动DNA四面体纳米探针。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述第一反应的反应条件为： 95℃5min、 72 ℃5min、 65℃5min、 55℃5min、 37℃10min、 25℃10min、 4℃； 所述第二反应的反应条件为： 50 ℃5min、 45℃10min、 40℃5min、 37℃30min、 30℃5min、 2 5℃30min、 2 0℃5min、 15℃5min、 10℃ 5min、 4℃。 6.一种熵驱动DNA链置换四面体的microRNA检测方法， 其特征在于， 所述检测方法包括 如下步骤： 将权利要求1所述的熵驱动DNA四面体纳米探针与待测 microRNA靶标混合孵育后进行 荧光检测即可识别待测靶标microRNA。 7.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述熵驱动DNA四面体纳米探针与待 测microRNA靶标的体积比为25:2。 8.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述孵育过程中还需要添加 熵驱动工 作液， 所述熵驱动工作液由10mM  Tris、 5mM MgCl2组成， pH为8.0 。 9.根据权利 要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述孵育的温度为35 ‑38℃， 所述孵育 的时间为1h 。 10.权利要求1所述的熵驱动DNA四面体纳米探针或权利要求6 ‑9任意一项所述的检测 方法在microRNA检测中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934046 A 2熵驱动DNA链置换四 面体的microRNA检测方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及microRNA检测技术领域， 具体涉及熵驱动DNA链置换四面体的 microRNA检测方法及其应用。 背景技术 [0002]microRNA(miRNA)是一类内源性非编码单链RNA分子， 在细胞分化和疾病发展中发 挥着重要作用。 大量研究表明， miRNA的异常表达与许多严重危害健康的恶性疾病密切相 关， 包括癌症、 心脑血管疾病和代谢类疾病等。 随着体外诊断(In ‑vitro diagnosis， IVD)技 术和纳米生物技术等新兴技术的迅速发展， 研究人员逐渐意识到miRNA在恶性肿瘤早期筛 查中作为一些特异 性和敏感性较差的传统蛋白生物标志物的优秀替代品具有巨大的潜力。 组织中存在丰富的miRNA， 在体液(血浆、 尿液、 腹膜液和唾液等)中也存在微量的循环 miRNA。 不同疾病具有不同的miRNA表达谱， 因此， 准确检测miRNA的水平对肿瘤的早期诊断 具有良好的前 景， 对有效的治疗管理和预后至关重要。 [0003]由于miRNA在 体液中的含量较低， 且由于序列较短导致不同类型的miRNA碱基序列 相似度较高， 因此， 足够的敏感性和优良的特异性是构建miRNA传感方法 的首要前提。 传统 的miRNA检测方法， 如实时定量聚合酶链反应(quantitative  real‑time polymerase   chain reaction， qRT ‑PCR)、 northernblotting和寡核苷酸芯片等， 由于耗时、 仪器试剂昂 贵、 需要核酸酶、 需要 热循环等因素限制， 阻碍了其在生物医学领域的广泛应用。 因此， 建立 一种无酶、 恒温、 灵敏度高、 特异度强的microRNA检测方法显得很有必要。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种熵驱动D NA四面体纳米探针， 可作为穿膜载 体， 以熵驱动DNA链置换动态回路实现细胞内靶标micr oRNA的无酶恒温级 联放大， 在无酶恒 温的情况 下， 即可完成对microRNA细胞内外的高灵敏、 高特异性检测。 [0005]为解决上述 技术问题， 本发明提供了以下技 术方案： [0006]本发明提供了一种熵驱动D NA四面体纳 米探针， 所述DNA四面体纳米探针由一条含 DNA识别序列的单链DNA  P3和五条单链DNAP 1、 P2、 P4、 P5、 P6构成， 所述的DNA识别序列能够 与待测microRNA结合。 [0007]优选的， 所述P1 ‑P6六条单链DNA的序列如SEQ  ID NO.1～6所示。 [0008]优选的， 所述P3单链DNA的第38位碱基后修饰有荧光基团， 所述P5单链DNA的3'端 修饰有淬灭基团。 [0009]本发明提供了一种制备 上述熵驱动DNA四面体纳米探针的方法， 所述方法包括： [0010]将P3、 P5、 P6单链DNA加入到缓冲液中， 经第一反应得到第一复合体； 将P1、 P2、 P4单 链DNA与第一复合体混合经第二反应即得 所述的熵驱动DNA四面体纳米探针。 [0011]优选的， 所述第一反应的反应条件为： 95℃5min、 72℃5min、 65℃5min、 55℃5min、 37℃10min、 2 5℃10min、 4℃； 所述第二反应的反应条件为： 50℃5min、 45℃10min、 40℃5min、说　明　书 1/5 页 3 CN 114934046 A 3