(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210760856.3 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 东北农业大 学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区长 江路600号 (72)发明人 郑洪亮　李翀　邹德堂　王敬国　 刘化龙　杨洛淼　辛威　贾琰　 (74)专利代理 机构 上海怡恩专利代理事务所 (普通合伙) 31336 专利代理师 牟俊玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 水稻苗期耐低温基因COLD1的KASP标记开发 及应用 (57)摘要 本发明公开了水稻苗期耐低温基因COLD1的 KASP标记开发及应用， 属于基因组序列及植物生 物技术领域。 为鉴定或辅助鉴定水稻低温耐性的 方法， 包括检测待测水稻的基因型， 根据待测水 稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻低温耐性； 所述 基因型为水稻基因组中KASP_COLD1位点的基因 型； 所述记KASP_COLD1位点是水稻基因组 中的一 个SNP位点， 其核苷酸种类为T或R， 为序列表中 SEQ ID No.4的第101位核苷酸。 本发明提供了一 种水稻苗期耐低温基因COLD1紧密连锁的KASP分 子标记开发与应用， 具有操作简便、 成本低廉、 检 测周期短、 标记稳定、 绿色环保等优点， 可精准检 测水稻苗期耐低温基因COLD1， 对促进耐低温水 稻育种具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图1页 CN 115094157 A 2022.09.23 CN 115094157 A 1.水稻苗期耐低温基因COLD1的KASP标记开发， 其特征在于： 为一种鉴定或辅助鉴定水 稻低温耐性的方法， 包括检测待测水稻的基因型， 根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定 水稻低温耐性； 所述基因型为水稻基因组中KASP_COLD1位点的基因型； 所述记KASP_COLD1 位点是水稻基因组中的一个SNP位点， 其核苷酸种 类为T或R， 为序列表中SEQ  ID No.4的第 101位核苷酸。 2.根据权利要求1所述的鉴定或辅助鉴定水稻低温耐性的方法， 其特征在于： 所述 KASP_COLD1位点的基因型为TT基因型或者TR基因型时， 水稻为耐低温或者候选为 耐低温所 述KASP_COLD1位点的基因型为RR基因型时， 水稻为不耐低温或者候选为不 耐低温； 其中， 所 述TT基因型表示水稻基因组中所述KASP_COLD1位点的核苷酸种 类为T的纯合型； 所述RR基 因型表示水稻基因组中所述KASP_COLD1位点的核苷酸种类为R的纯合型； 所述TR基因型表 示水稻基因 组中所述KAS P_COLD1位 点的核苷酸种类为T和R的杂合型。 3.根据权利要求1所述的与水稻苗期耐低温基因COLD1紧密连锁的KASP标记开发的应 用， 其特征在于： （1） 检测水稻基因组中KASP_C OLD1位点的多态 性或基因型的物质在鉴定或 辅助鉴定水稻低温 耐性中的应用； （2） 检测水稻基因组中KASP_COLD1位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助 鉴 定耐低温水稻产品中的应用； （3） 检测水稻基因组中KASP_COLD1位点的多态性或基因型的物质在 水稻辅助育种或制 备水稻辅助育种产品中的应用； （4） 检测水稻基因组中KASP_COLD1位点的多态性或基因型的物质在选育耐低温的水稻 资源中的应用。 4.根据权利要求1 ‑2中任一所述的方法、 权利要求3所述的应用， 其特征在于： 所述检测 检测水稻基因 组中KASP_COLD1位 点的多态性或基因型的物质为如下D1） 、 D2） 或D3） ： D1） 所述检测检测水稻基因组中KASP_COLD1位点的多态性或基因型的物质含有扩增包 括所述KAS P_COLD1位 点在内的水稻基因 组DNA片段的PCR引物； D2） 所述检测水稻基因组中KASP_COLD1位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR 引物的PCR试剂； D3） 含有D1） 所述PCR引物或D2） 所述PCR试剂的试剂盒。 5.根据权利要求 4所述的应用、 方法， 其特 征在于： 所述PCR引物为P1或P2： P1、 所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.1的第22 ‑44位的单链DNA、 核 苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.2的第22 ‑44位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ  ID  No.3的单链DNA组成的引物组； P2、 所述PCR引物为由序列表中SEQ  ID No.1所示的单链DNA、 序列表中SEQ  ID No.2所 示的单链DNA和由序列表中SEQ  ID No.3所示的单链DNA的引物组。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094157 A 2水稻苗期耐低温 基因COLD1的KASP标记开发及应用 技术领域 [0001]本发明涉及水稻苗期耐低温基因COLD1的KASP标记开发及应用， 属于基因组序列 及植物生物技 术领域。 背景技术 [0002]水稻(Oryza  sativa)是我国三大主要粮食作物之一， 种植面积占粮食作物种植总 面积的三分之一。 同时， 水稻还是重要的工业加工原料， 常用于制作淀粉、 酿 酒、 制醋及医药 等等(徐家安,王健康,王友霜,等."多用途"在水稻生产上的应用效果初探[C]第三届全国 有机肥研究开发暨产业化应用新产品,新工艺,新设备交流研讨会.2016.)。 因此， 水稻对我 国民生保障有着重要的战略意 义， 水稻产量 提升是我国研究的重要方向。 [0003]水稻是一种 温度敏感型作物， 低温冷害会造成水稻严重减产。 低温冷害在世界上 许多国家均有发生， 尤以澳 大利亚南部、 日本、 朝鲜和中 国的东北稻作区(辽宁、 吉林和黑龙 江)最为常见， 灾害严重时可减产30％以上。 培育耐低 温水稻是解决这一问题的重要途径， 利用耐低温基因连锁分子标记在水稻苗期从DNA水平对目标植株进 行低温耐性选择是提高 耐低温水稻育种效率的有效途径(赵明辉,张文忠,马殿荣,等.水稻耐冷基因研究进展[J]. 沈阳农业大学学报,2012,43(6):8.)。 目前， 仅克隆了部分耐低温基因， 如bZIP73基因和 OsCOLD1基因， 并且开发了连锁分子标记(田孟祥,张时龙,何友勋,等.水稻耐低温基因 bZIP73分子标记的开发与验证[J].江苏农业学报,2019,35(6):6.； 杨佳,曹黎明,周继华, 等.水稻耐低温基因COLD1功能标记的开发及应用[J].分子植物育种,2019,17(18):5.)。 然 而目前常用的标记如SSR标记、 InDel标记或CAPS标记， 虽然可以用于分子标记辅助选择， 但 检测效率低， 还可能会产生气溶胶污染环境， 不 适用于高通 量的分子检测平台。 [0004]KASP(Kompetit ive Allele‑Specific  PCR， 竞争性等位基因特异 性PCR)通过荧光 探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果， 可用于检测SNP位点和InDel位点。 与SSR、 RFLP、 InDel等分子标记相比， KASP标记具有检测快速， 成本低， 易于规模化应用等特点， 更 加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。 因此， 开发适合于高通量分子检测平台 的水稻粒型KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用， 提高我国水稻的育种效率和 育种水平具有重要意 义。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种与水稻苗期耐低温基因COLD1的KASP标记开发及其应用 方法。 [0006]本发明提供一种与水稻苗期耐低温基因COLD1紧密连锁的KASP分子标记KASP_ COLD1， 所述KASP_COLD1是水稻基因组中的一个SNP位点， 其核苷酸种类为T或R(A/G简并碱 基)， 为序列表中SEQ  ID No.4的第101位核苷酸。 [0007]所述与水稻苗期耐低温基因COLD1紧密连锁的KASP分子标记在C1、 C2、 C3或C4中的 应用也应在本发明的保护范围之内：说　明　书 1/7 页 3 CN 115094157 A 3