(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210695090.5 (22)申请日 2022.06.20 (71)申请人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92号 (72)发明人 高芬　赵丽梅　赵利　 (74)专利代理 机构 山西五维专利事务所(有限 公司) 1410 5 专利代理师 张福增 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的 引物和PCR方法 (57)摘要 本发明提供一种检测黄芪及土壤中根腐病 菌腐皮镰刀菌的引物和PCR方法， 所述引物的序 列为： FP.F： 5 ’—CTGCTTATCTCGGGTCGTGG—3 ’, FP.R： 5’—CTTGTCGATACCACCGCACT—3 ’。 本发明 还提供一种利用所述引物快速检测黄芪及土壤 中根腐病菌腐皮镰刀菌的PCR方法， 该检测方法 灵敏度高、 特异性强， 且具有操作方便、 成本低、 结果直观 等特点， 可用于田间黄芪植株或其种植 区土壤中黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的特异分子 检测， 检测结果是根腐病的早期快速鉴别和诊 断、 病原菌确定的依据， 也可作为土壤中病原菌 含量的预警检测方法。 本发明是为针对黄芪根腐 病进行靶向性早期防治和科学合理用药提供直 接依据的有力技术手段， 对减少根腐病造成的经 济损失具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图3页 CN 114959102 A 2022.08.30 CN 114959102 A 1.一种检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀 菌的特异性引物对， 所述特异性引物对的 序列如下： FP.F： 5’—CTGCTTATCTCGGGTCGTGG—3’, FP.R： 5’—CTTGTCGATAC CACCGCACT—3 ’。 2.如权利要求书1所述的特异性引物对在检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀 菌中的 应用。 3.一种利用权利要求1所述的特异性引物对快速检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀 菌的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)取黄芪 发病样品或种植地的发病土壤， 分别通过Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂 盒和Ezup柱式土壤DNA抽提试剂盒提取黄芪发病样本及土壤的DNA； (2)以步骤(1)提取的DNA为模板， 利用权利要求书1所述 的特异性引物对FP.F/FP.R进 行基于荧 光染料SYBRGre enI的实时荧 光PCR检测； (3)利用权利要求书1所述的特异性引物对， 以不同浓度梯度的黄芪根腐病菌腐皮镰刀 菌的DNA为模板， 进行实时荧光PCR检测， 制作黄芪发病样本检测的标准曲线； 同样， 利用权 利要求书1所述的特异性引物对， 以模拟不同梯度的黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌带菌量的土 壤DNA为模板， 进行实时荧 光PCR检测， 制作土壤 检测的标准曲线； (4)根据步骤(2)中的检测结果判断黄芪植株及土壤是否带有根腐病菌腐皮镰刀菌； 根 据步骤(3)获得的标准曲线， 对黄芪植株及土壤中的根腐病菌腐皮镰刀菌的生物量进行计 算。 4.如权利要求3所述的快速检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的方法， 其特征在 于， 所述步骤(2)或步骤(3)中检测黄芪的实时荧光PCR检测的反应条件： 95℃3min； 95℃5s； 64℃20s， 35个循环， 溶解曲线分析温度 设于65～95℃之间； 反应体系： 反应总 体积20 μL， 其 组分为： SYBRGreen  I荧光染料10 μL， 模板DNA  2 μL， 引物各2 μL(浓度为2 μM)， ddH2O补足20 μ L。 5.如权利要求3所述的快速检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的方法， 其特征在 于， 所述步骤(2)或步骤(3)中检测土壤的实时荧光PCR检测的反应条件： 95℃3min； 95℃5s； 64℃20s， 40个循环， 反应体系： 反应总体积20 μL， 其组分为： SYBRGreen  I荧光染料10 μL， 模 板DNA 4 μL， 引物各2 μL(浓度为2 μM)， d dH2O补足20 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959102 A 2检测黄芪及 土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的引物和PCR方 法 技术领域 [0001]本发明属于农业生物技术领域， 具体涉及一种黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌 (Fusarium  solani)分子检测的特异引物及其在黄芪及土壤中的实时荧光定量PCR检测方 法。 背景技术 [0002]黄芪， 具有补气固表， 托疮生肌等功效， 是中医药学公认的道地大宗药材和保健品 原料， 以其为原料的中成药多达200余种， 上市保健品达160余种， 民间也将黄芪作为重要的 滋补食材。 近年来， 黄芪的市场需求激增， 出口、 药用、 食用和其他用途的年需求量在8.8 5万 吨以上。 然而， 随着种植面积扩大、 轮作周期缩短、 重茬和迎茬面积增加等因素， 素有 “植物 癌症”之称的根腐病在甘肃、 山西、 内蒙等主产区普遍发生， 且危害逐年加重， 如甘肃渭源和 定西， 发病率分别为40％ ‑60％和35％ ‑92％； 内蒙古为30％ ‑80％； 山西一般为10％ ‑30％， 重者达60％。 根腐病的发生蔓延给黄芪产业的发展造成了严重影响， 经济损失巨大。 [0003]尽早准确判别植物病害和明确其致病菌/群， 是对病害进行有效防控的最关键一 环。 然而， 黄芪 根腐病致病菌的复杂性、 症状的多样性、 发病的 隐蔽性和多年性， 给该病害的 早期鉴别和针对病原实施精准防控造成了极大困扰。 首先， 黄芪根腐病由多种病原菌混合 侵染引起， 镰刀菌属的腐皮镰刀菌(Fusarium  solani)、 锐顶镰刀菌(Fusarium   acuminatum)、 尖孢镰刀菌(Fusarium  oxysporum)是最主要的致病菌， 且不同地区优势致病 菌存在差异， 如甘肃省渭源县黄芪根腐病的优势致病菌为尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌； 内蒙 古以立枯丝核菌(Rhizoctonia  solani)为主要致病 菌， 其次是尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌； 山西省为锐顶镰刀菌、 腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌。 其次， 黄芪根腐病症状多样， 具有一定地 域差异， 且引发不同症状的优势 致病菌也不尽相同。 以山西为例， 纤维状腐烂和皱缩变软在 浑源、 应县和五寨县均有分布， 前者以浑源县和五寨县为多， 后者以应县居多； 而侧 根发黑 在浑源县未被发现。 引起纤维状腐烂的致病菌， 浑源县主要为锐顶镰刀菌、 腐皮镰刀菌， 五 寨县为锐顶镰刀菌、 尖孢镰刀菌， 应县则为锐顶镰刀菌； 引起皱缩软根症状的致病菌， 五寨 县主要为尖孢镰刀菌、 锐顶镰刀菌、 腐皮镰刀菌； 浑源县为链格孢菌(Alternaria  spp.)、 锐 顶镰刀菌、 腐皮镰刀菌； 应县为腐皮镰刀菌和锐顶镰刀菌； 引起侧 根发黑的致病菌， 五寨县 和应县均主要为锐顶镰刀菌和腐皮镰刀菌。 第三， 黄芪根腐病作为土传病害具有隐蔽性。 当 症状在植株地上部肉眼明显可见时， 根部往往已是病害发生的中后期， 此时常规施用农药 已基本无效， 药农不得不加大用量； 加之黄芪 为多年生植物， 为了防止病菌在后续生长年份 继续经土壤传播危害， 还需要长期用药加以控制。 如此， 农药用量一再加大， 很难控制在合 理的范围。 [0004]目前， 黄芪根腐病病原菌 的鉴定通常采用的是先从发病组织中分离和纯化、 再通 过形态学和分子生物学技术加以鉴定， 这种鉴定方法通常耗时长达半年以上， 无法实现病 菌的快速鉴定。 在田间， 症状观察是根腐病诊断的唯一手段， 但根腐病早期症状的不明显和 隐蔽性， 常使得即便药农凭经验通过田间症状观 察发现了病害， 也往往已到发病后 期； 加之说　明　书 1/8 页 3 CN 114959102 A 3