(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210732815.3 (22)申请日 2022.06.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114807360 A (43)申请公布日 2022.07.29 (73)专利权人 北京贝瑞和康生物技 术有限公司 地址 102206 北京市昌平区科技园区生命 园路4号院5号楼8层801 (72)发明人 孟万利　詹嘉晗　毛爱平　李佳琪　 卢玉林　张丽　任志林　 (74)专利代理 机构 北京市金杜律师事务所 11256 专利代理师 孟凡宏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 112746102 A,2021.0 5.04 CN 110157782 A,2019.08.23 WO 2011046518 A1,201 1.04.21 WO 2013131981 A1,2013.09.12 US 202124185 0 A1,2021.08.0 5 Erick W. L oomis等.Sequenci ng the unsequenceable: Expanded CG G-repeat alleles of the fra gile X gene. 《Gen ome Research》 .2013,第23卷 何文智等.三核苷酸重复引物PCR和甲基化 特异性多重连接 探针扩增技 术在脆性X综合征产 前诊断中的应用. 《中华 生殖与避孕杂志》 .2017, 第37卷(第7期), 审查员 刘晓晨 (54)发明名称 检测脆性X综合征突变的方法和试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种检测脆性X综合征突变的方 法和试剂盒。 其中所述试剂盒包括以下试剂： （1） 用于长片段PCR扩增的试剂； （2） 用于高GC区域 PCR扩增的试剂； 和 （3） 用于构建三代测序文库的 试剂。 其中所述方法包括以下步骤： （1） 获取受试 者样本； （2） 对所述样本进行长片段PCR扩增和高 GC PCR扩增； （3） 构建三代测序文库； （4） 测序并 分析FMR1基因突变 类型。 权利要求书2页 说明书18页 序列表35页 附图7页 CN 114807360 B 2022.09.02 CN 114807360 B 1.一种用于扩增脆性X综合征中多种突变的引物组， 包括选自以下四组中的每组引物 的一对或多对： （1） FMR1 ‑E1‑F与FMR1‑E1‑R， 其中所述FMR1 ‑E1‑F选自SEQ  ID NO： 1‑4， FMR1‑E1‑R选自 SEQ ID NO： 5‑8； （2） FMR1‑E2‑F与FMR1‑E9‑R， 其中所述FM R1‑E2‑F选自SEQ  ID NO： 9‑11， FMR1‑E9‑R选自 SEQ ID NO： 12‑14； （3） FMR1 ‑E10‑F与FMR1‑E17‑R， 其中所述FM R1‑E10‑F选自SEQ  ID NO： 15‑17， FMR1‑E17‑ R选自SEQ  ID NO： 18‑20； 和 （4） FMR1‑Gap‑Mix， 其中所述FMR 1‑Gap‑Mix选自SEQ  ID NO： 21‑220； 其中， 所述脆性X综合征中多种突变包括以下多种突变： FMR1的由CGG扩张引起的前突 变和全突变、 CG G重复中的AG G插入、 大片段缺失、 点 突变和微 缺失。 2.根据权利要求1所述的引物组， 其中， 所述引 物在5’端包括5‑50nt不同序列的DNA条 形码。 3.权利要求1 ‑2任一项所述的引物组在制备用于检测脆性X综合征中多种突变种的试 剂盒中的用途， 其中， 所述脆性X综合征中多种突变包括以下多种突变： FMR1的由C GG扩张引 起的前突变和全突变、 CG G重复中的AG G插入、 大片段缺失、 点 突变和微 缺失。 4.一种用于检测脆 性X综合征中多种突变的试剂盒， 包括以下 试剂： （1） 用于 长片段PCR扩增的试剂； （2） 用于高GC  PCR扩增的试剂； （3） 用于构建三代测序文库的试剂； 其中， 所述用于PCR扩增的试剂包 含权利要求1 ‑2任一项所述的引物组； 其中， 所述脆性X综合征中多种突变包括以下多种突变： FMR1的由CGG扩张引起的前突 变和全突变、 CG G重复中的AG G插入、 大片段缺失、 点 突变和微 缺失。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中， 所述长片段PCR扩增和高GC  PCR扩增在一个或 者两个反应管中完成。 6.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中， 所述用于长片段PCR扩增的试剂包括DNA聚合 酶、 反应缓冲液和引物。 7.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中， 所述用于高GC  PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、 反应缓冲液和引物。 8.根据权利要求4所述的试剂 盒， 其中， 所述用于构建三代测序文库的试剂包括末端修 复酶、 接头、 连接酶、 DNA纯化磁珠、 反应缓冲液和外切酶。 9.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中， 所述三代测序选自Pacific  Biosciences公司 的PacBio测序或Oxford  Nanopore Technologies公司的Nan opore测序。 10.一种用于检测脆 性X综合征中多种突变的系统， 包括以下模块： （1） 采集模块： 获取受试者样本； （2） 扩增模块： 对所述样本进行长片段PCR扩增 和高GC PCR扩增； （3） 文库构建模块： 构建三代测序文库； （4） 测序模块： 测序并分析 FMR1基因突变 类型； 其中， 所述模块 （2） 中的PCR扩增采用权利要求1 ‑2任一项所述的引物组进行；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807360 B 2其中， 所述脆性X综合征中多种突变包括以下多种突变： FMR1的由CGG扩张引起的前突 变和全突变、 CG G重复中的AG G插入、 大片段缺失、 点 突变和微 缺失。 11.根据权利要求10所述的系统， 其中， 所述长片段PCR扩增样本中的FMR1  E2‑9、 FMR1  E10‑17片段。 12.根据权利要求10所述的系统， 其中， 所述高GC  PCR扩增样本中的FMR 1 E1片段。 13.根据权利要求10所述的系统， 其中， 所述长片段PCR扩增和高GC  PCR扩增在一个或 者两个反应管中完成。 14.根据权利要求10所述 的系统， 其中， 所述三代测序选自Pacific  Biosciences公司 的PacBio测序或Oxford  Nanopore Technologies公司的Nan opore测序。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807360 B 3